甘油半乳糖苷棕榈酸酯的酶法合成及分离纯化
甘油半乳糖苷棕榈酸酯的酶法合成及分离纯化[2020050809]
摘要：以甘油半乳糖苷及棕榈酸为原料，在丙酮体系中，以固定化脂肪酶Novozyme435为催化剂，通过酯化反应合成甘油半乳糖苷棕榈酸酯。研究了反应溶剂、酶添加量、底物摩尔比、反应温度、反应时间对酶促甘油半乳糖苷棕榈酸酯合成的影响，以确定其较优的合成反应体系。并对其分离纯化条件进行了研究。实验结果表明，最适反应条件为：丙酮为反应溶剂，脂肪酶Novozyme435的浓度为12mg/ml，底物甘油半乳糖苷与棕榈酸摩尔比为1：4，反应温度为55℃，反应时间为24h，转速为120rpm。此时的酯转化率达99.2%。硅胶柱层析最适实验条件：填料为硅胶100~200目，淋洗液1为氯仿：甲醇：乙酸（99.5：0.5：0.05，V/V/V)，淋洗液2为氯仿：甲醇：水（11：2：1，V/V/V），流速为0.5ml/min。薄层层析最适实验条件：展开剂为二氯甲烷：甲醇（9：1，V/V）。通过柱层析法获得甘油半乳糖苷棕榈酸单酯和二酯，其纯度高达98%以上。
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关键字:甘油半乳糖苷棕榈酸酯；酶法合成；分离纯化；甘油半乳糖苷
目录
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摘要2
关键词2
Abstract2
Key words2
引言2
1 材料与方法3
1.1 材料 3
1.1.1 主要试剂 3
1.1.2 主要仪器 3
1.2 方法 3
1.2.1 甘油半乳糖苷棕榈酸酯的合成3
1.2.2 甘油半乳糖苷棕榈酸单酯及其二酯的分离纯化3
1.2.3 甘油半乳糖苷棕榈酸酯的定量分析3
1.2.4 甘油半乳糖苷棕榈酸酯转化率的计算4
2 结果与分析4
2.1 标准曲线的绘制4
2.2 单因素实验5
2.2.1 反应溶剂的影响5
2.2.2 酶添加量的影响6
2.2.3 底物摩尔比的影响7
2.2.4 反应时间的影响8
2.2.5 反应温度的影响9
2.3 分离纯化实验10
2.3.1 甘油半乳糖苷棕榈酸酯硅胶柱层析试验10
2.3.2 甘油半乳糖苷棕榈酸酯薄层层析试验10
2.3.3 甘油半乳糖苷棕榈酸单酯及其二酯的HPLC-ELSD检测10
3 结论 11
致谢12
参考文献12
甘油半乳糖苷棕榈酸酯的酶法合成及分离纯化
引言
甘油糖脂(Glyceroglycolipid)，又称为糖基甘油酯（Glycoglyceride），是以甘油为共同组成成分、而糖分子直接或间接地结合在脂肪酸上的糖脂的总称。这类糖基化的甘油醇酯类物质广泛存在于动物的 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: 3_5_1_9_1_6_0_7_2
神经组织、植物和微生物中，且具有抗氧化、抗病毒、抗菌、抗肿瘤、抗炎、抗动脉粥样硬化等多种生物活性[1]。以甘油半乳糖苷和脂肪酸为原料形成甘油糖脂主要有两种途径，一种是脂肪酸分子连在半乳糖分子上，另一种是脂肪酸分子连在甘油分子上。这两种途径在合成过程中会随着合成环境的不同而有所偏向性，酶催化反应的区域选择性的不同取决于第二羟基之间的反应或培养基上第一和第二羟基之间的反应[2]。如何正确且高效地生成所需要的产物正是目前研究热点之一。
甘油半乳糖苷与脂肪酸合成时常用的方法主要有化学合成及酶法合成，由于酯化反应是一类有机化学反应，是醇跟羧酸生成酯和水的反应，其本身反应可逆且反应速率非常慢，再加上糖分子与甘油分子上的羟基比较多，所以导致化学合成的条件苛刻且副产物多。相比与化学法，酶催化法具有反应条件温和、效率高、选择性强、副产物少等特点[3]，且绿色环保，符合社会对于可持续发展的要求。本实验以前期实验室合成的甘油半乳糖苷为底物之一，通过非水介质中脂肪酶催化的酯化反应来合成甘油半乳糖苷棕榈酸酯，研究了相关因素对酶促反应的影响，并对产物的分离纯化进行了研究。
1 材料与方法
1．1 材料
1．1．1 主要试剂
甘油半乳糖苷，本实验室自制；棕榈酸，化学纯，上海凌峰化学试剂有限公司；甲醇，色谱纯，国药集团化学试剂有限公司；叔戊醇，化学纯，国药集团化学试剂有限公司；高纯氮（N2），江苏天鸿化工有限公司气体分公司；固定化脂肪酶Novozyme435（Candida Antarctica），丹麦Novozyme酶制剂公司（Bagsvaerd，Denmark）；分子筛4A型，南京宁试化学试剂有限公司。
其他试剂均为分析纯。
1．1．2 主要仪器
Sartorious电子精密天平，北京赛多利斯天平有限公司；SHZ-88A往复式水浴恒温振荡器，太仓市实验设备厂；高效液相色谱仪（1200），美国Agilent公司；Alltech ELSD 2000检测器，美国Alltech公司；SB-5200DT超声波清洗机，宁波新芝生物科技股份有限公司；旋转蒸发器RE 52-99，上海亚荣生化仪器厂。
1．2 方法
1．2．1 甘油半乳糖苷棕榈酸酯的合成
用电子精密天平称取甘油半乳糖苷0.1mmol(0.762g)、棕榈酸0.4mmol(0.1024g)与Novozyme435脂肪酶0.06g于30ml具塞螺旋玻璃试管中，加入5ml丙酮后振荡混匀，放入55℃、120rpm的水浴恒温振荡器中反应3小时，后加入4A型分子筛70mg/ml（约3颗）继续反应，总反应时间为24小时。通过过滤酶来终止反应。所有反应同时进行三个平行试验，最终取其平均值。
1．2．2 甘油半乳糖苷棕榈酸单酯及其二酯的分离纯化
硅胶柱层析：先通过过滤除去固定化脂肪酶，用旋转蒸发器蒸干丙酮，以样品：氯仿（1：5，M/V）的比例复溶，并超声5~6min混匀，进行硅胶柱（硅胶100~200目，22mm×35cm玻璃柱）层析。用氯仿平衡1个柱体积后上样1~2ml，用氯仿：甲醇：乙酸（99.5：0.5：0.05，V/V/V）的淋洗液1洗脱1个柱体积除去废液甲醇，继续用淋洗液1洗脱1个柱体积收集脂肪酸。随后用氯仿：甲醇：水（11：2 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: 3_5_1_9_1_6_0_7_2
：1，V/V/V）的淋洗液2洗脱1个柱体积继续收集脂肪酸，继续用淋洗液2洗脱2~3个柱体积开始分管收集样品，然后用甲醇洗脱1个柱体积继续分管收集样品。流速为0.5ml/min，每管收集15ml，得到甘油半乳糖苷棕榈酸单酯及其二酯的纯品，其中二酯先被洗脱，单酯后被洗脱。再用甲醇洗脱1个柱体积收集未反应的底物甘油半乳糖苷。
薄层层析：用微量进样器取100μl样液点于硅胶板的近底端1cm处，用二氯甲烷：甲醇（9：1，V/V）展开20min，碘熏显色30min。观察硅胶柱层析的分离结果。
1．2．3 甘油半乳糖苷棕榈酸酯的定量分析
用微量进样器取已过膜过滤的样液200μl至1.5ml具塞螺旋玻璃样品瓶内，用高纯氮气吹干，再用400μl甲醇复溶，超声混匀，HPLC-ELSD检测。
HPLC条件：色谱柱为ZORBA SB C18色谱柱（5μm，4.6mm×250mm，Agilent，U.S.A.），流动相为甲醇：水（95：5，V/V）。流动相流速保持在0.5ml/min。
ELSD检测器参数：漂移管温度55℃，ELSD增益值为1，载气为氮气，压力0.5MPa，洗脱20min。
甘油半乳糖苷棕榈酸酯的HPLC-ESLD图谱见图1，其中甘油半乳糖苷出峰时间约为4.3min，单酯出峰时间约为9.1min，二酯出峰时间约为11.2min，棕榈酸出峰时间约为15.1min。
图1 反应混合物HPLC图谱
1．2．4 甘油半乳糖苷棕榈酸酯转化率的计算
2 结果与分析
2．1 标准曲线的绘制
将纯品单酯配成一系列浓度的溶液，HPLC-ELSD检测（表1）。
表1 甘油半乳糖苷棕榈酸单酯标准曲线制备
编号 1 2 3 4 5
浓度/mg/ml 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0
峰面积 5261.9 17340.9 27538 54440.9 76278.3
图9 甘油半乳糖苷棕榈酸单酯的HPLC-ELSD图谱
摘要：以甘油半乳糖苷及棕榈酸为原料，在丙酮体系中，以固定化脂肪酶Novozyme435为催化剂，通过酯化反应合成甘油半乳糖苷棕榈酸酯。研究了反应溶剂、酶添加量、底物摩尔比、反应温度、反应时间对酶促甘油半乳糖苷棕榈酸酯合成的影响，以确定其较优的合成反应体系。并对其分离纯化条件进行了研究。实验结果表明，最适反应条件为：丙酮为反应溶剂，脂肪酶Novozyme435的浓度为12mg/ml，底物甘油半乳糖苷与棕榈酸摩尔比为1：4，反应温度为55℃，反应时间为24h，转速为120rpm。此时的酯转化率达99.2%。硅胶柱层析最适实验条件：填料为硅胶100~200目，淋洗液1为氯仿：甲醇：乙酸（99.5：0.5：0.05，V/V/V)，淋洗液2为氯仿：甲醇：水（11：2：1，V/V/V），流速为0.5ml/min。薄层层析最适实验条件：展开剂为二氯甲烷：甲醇（9：1，V/V）。通过柱层析法获得甘油半乳糖苷棕榈酸单酯和二酯，其纯度高达98%以上。
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摘要2
关键词2
Abstract2
Key words2
引言2
1 材料与方法3
1.1 材料 3
1.1.1 主要试剂 3
1.1.2 主要仪器 3
1.2 方法 3
1.2.1 甘油半乳糖苷棕榈酸酯的合成3
1.2.2 甘油半乳糖苷棕榈酸单酯及其二酯的分离纯化3
1.2.3 甘油半乳糖苷棕榈酸酯的定量分析3
1.2.4 甘油半乳糖苷棕榈酸酯转化率的计算4
2 结果与分析4
2.1 标准曲线的绘制4
2.2 单因素实验5
2.2.1 反应溶剂的影响5
2.2.2 酶添加量的影响6
2.2.3 底物摩尔比的影响7
2.2.4 反应时间的影响8
2.2.5 反应温度的影响9
2.3 分离纯化实验10
2.3.1 甘油半乳糖苷棕榈酸酯硅胶柱层析试验10
2.3.2 甘油半乳糖苷棕榈酸酯薄层层析试验10
2.3.3 甘油半乳糖苷棕榈酸单酯及其二酯的HPLC-ELSD检测10
3 结论 11
致谢12
参考文献12
甘油半乳糖苷棕榈酸酯的酶法合成及分离纯化
引言
甘油糖脂(Glyceroglycolipid)，又称为糖基甘油酯（Glycoglyceride），是以甘油为共同组成成分、而糖分子直接或间接地结合在脂肪酸上的糖脂的总称。这类糖基化的甘油醇酯类物质广泛存在于动物的 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: 3_5_1_9_1_6_0_7_2
神经组织、植物和微生物中，且具有抗氧化、抗病毒、抗菌、抗肿瘤、抗炎、抗动脉粥样硬化等多种生物活性[1]。以甘油半乳糖苷和脂肪酸为原料形成甘油糖脂主要有两种途径，一种是脂肪酸分子连在半乳糖分子上，另一种是脂肪酸分子连在甘油分子上。这两种途径在合成过程中会随着合成环境的不同而有所偏向性，酶催化反应的区域选择性的不同取决于第二羟基之间的反应或培养基上第一和第二羟基之间的反应[2]。如何正确且高效地生成所需要的产物正是目前研究热点之一。
甘油半乳糖苷与脂肪酸合成时常用的方法主要有化学合成及酶法合成，由于酯化反应是一类有机化学反应，是醇跟羧酸生成酯和水的反应，其本身反应可逆且反应速率非常慢，再加上糖分子与甘油分子上的羟基比较多，所以导致化学合成的条件苛刻且副产物多。相比与化学法，酶催化法具有反应条件温和、效率高、选择性强、副产物少等特点[3]，且绿色环保，符合社会对于可持续发展的要求。本实验以前期实验室合成的甘油半乳糖苷为底物之一，通过非水介质中脂肪酶催化的酯化反应来合成甘油半乳糖苷棕榈酸酯，研究了相关因素对酶促反应的影响，并对产物的分离纯化进行了研究。
1 材料与方法
1．1 材料
1．1．1 主要试剂
甘油半乳糖苷，本实验室自制；棕榈酸，化学纯，上海凌峰化学试剂有限公司；甲醇，色谱纯，国药集团化学试剂有限公司；叔戊醇，化学纯，国药集团化学试剂有限公司；高纯氮（N2），江苏天鸿化工有限公司气体分公司；固定化脂肪酶Novozyme435（Candida Antarctica），丹麦Novozyme酶制剂公司（Bagsvaerd，Denmark）；分子筛4A型，南京宁试化学试剂有限公司。
其他试剂均为分析纯。
1．1．2 主要仪器
Sartorious电子精密天平，北京赛多利斯天平有限公司；SHZ-88A往复式水浴恒温振荡器，太仓市实验设备厂；高效液相色谱仪（1200），美国Agilent公司；Alltech ELSD 2000检测器，美国Alltech公司；SB-5200DT超声波清洗机，宁波新芝生物科技股份有限公司；旋转蒸发器RE 52-99，上海亚荣生化仪器厂。
1．2 方法
1．2．1 甘油半乳糖苷棕榈酸酯的合成
用电子精密天平称取甘油半乳糖苷0.1mmol(0.762g)、棕榈酸0.4mmol(0.1024g)与Novozyme435脂肪酶0.06g于30ml具塞螺旋玻璃试管中，加入5ml丙酮后振荡混匀，放入55℃、120rpm的水浴恒温振荡器中反应3小时，后加入4A型分子筛70mg/ml（约3颗）继续反应，总反应时间为24小时。通过过滤酶来终止反应。所有反应同时进行三个平行试验，最终取其平均值。
1．2．2 甘油半乳糖苷棕榈酸单酯及其二酯的分离纯化
硅胶柱层析：先通过过滤除去固定化脂肪酶，用旋转蒸发器蒸干丙酮，以样品：氯仿（1：5，M/V）的比例复溶，并超声5~6min混匀，进行硅胶柱（硅胶100~200目，22mm×35cm玻璃柱）层析。用氯仿平衡1个柱体积后上样1~2ml，用氯仿：甲醇：乙酸（99.5：0.5：0.05，V/V/V）的淋洗液1洗脱1个柱体积除去废液甲醇，继续用淋洗液1洗脱1个柱体积收集脂肪酸。随后用氯仿：甲醇：水（11：2 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: 3_5_1_9_1_6_0_7_2
：1，V/V/V）的淋洗液2洗脱1个柱体积继续收集脂肪酸，继续用淋洗液2洗脱2~3个柱体积开始分管收集样品，然后用甲醇洗脱1个柱体积继续分管收集样品。流速为0.5ml/min，每管收集15ml，得到甘油半乳糖苷棕榈酸单酯及其二酯的纯品，其中二酯先被洗脱，单酯后被洗脱。再用甲醇洗脱1个柱体积收集未反应的底物甘油半乳糖苷。
薄层层析：用微量进样器取100μl样液点于硅胶板的近底端1cm处，用二氯甲烷：甲醇（9：1，V/V）展开20min，碘熏显色30min。观察硅胶柱层析的分离结果。
1．2．3 甘油半乳糖苷棕榈酸酯的定量分析
用微量进样器取已过膜过滤的样液200μl至1.5ml具塞螺旋玻璃样品瓶内，用高纯氮气吹干，再用400μl甲醇复溶，超声混匀，HPLC-ELSD检测。
HPLC条件：色谱柱为ZORBA SB C18色谱柱（5μm，4.6mm×250mm，Agilent，U.S.A.），流动相为甲醇：水（95：5，V/V）。流动相流速保持在0.5ml/min。
ELSD检测器参数：漂移管温度55℃，ELSD增益值为1，载气为氮气，压力0.5MPa，洗脱20min。
甘油半乳糖苷棕榈酸酯的HPLC-ESLD图谱见图1，其中甘油半乳糖苷出峰时间约为4.3min，单酯出峰时间约为9.1min，二酯出峰时间约为11.2min，棕榈酸出峰时间约为15.1min。
图1 反应混合物HPLC图谱
1．2．4 甘油半乳糖苷棕榈酸酯转化率的计算
2 结果与分析
2．1 标准曲线的绘制
将纯品单酯配成一系列浓度的溶液，HPLC-ELSD检测（表1）。
表1 甘油半乳糖苷棕榈酸单酯标准曲线制备
编号 1 2 3 4 5
浓度/mg/ml 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0
峰面积 5261.9 17340.9 27538 54440.9 76278.3
图9 甘油半乳糖苷棕榈酸单酯的HPLC-ELSD图谱
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