麦麸中抗真菌活性乳酸菌的筛选鉴定
许多研究证明乳酸菌能够通过形成酸性物质以及抗微生物活性物质抑制真菌及其毒素的产生。而很多自发发酵的食物，如麦麸，酸面团等，是益生乳酸菌的来源。本文从自发酵的麦麸中分离筛选出对黄曲霉（Aspergillus flavus）、黑曲霉（Aspergillus Niger）以及禾谷镰刀菌（Fusarium graminearum）有显著抑制作用的乳酸菌菌株，在此基础上，将这些菌株按照生化以及生理性状进分类，并使用分子生物学16S rDNA序列分析法进行分析和鉴定。主要研究结果如下将自发酵的麦麸中的乳酸菌进行分离、纯化和初步鉴定得到7株异型乳酸菌，30株同型乳酸菌。以禾谷镰刀菌、黄曲霉、黑曲霉为指示菌，筛选具有抗真菌活性的乳酸菌，共得到8株具有较好抗真菌效果的乳酸菌，包括2d-m8，12d-m7，10d-m4，13d-m3，11d-m9，11d-m1，8d-m4，8d-m5以及2d-m4。通过16S rDNA 序列鉴定确定2d-m8为类肠膜魏斯氏菌，其余均为植物乳杆菌。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1 材料与方法2
1.1 材料与试剂 2
1.2菌种及主要培养基2
1.3主要仪器与设备2
1.4实验方法2
1.4.1样品的采集及处理2
1.4.2乳酸菌的分离纯化3
1.4.3革兰氏染色、过氧化氢酶试验及菌落形态观察3
1.4.4葡萄糖产酸产气实验3
1.4.5抑霉菌乳酸菌的筛选3
1.4.6菌株16SrDNA鉴定4
1.4.6.1菌株基因组 DNA 提取4
1.4.6.2 PCR 扩增 16S rDNA 序列4
1.4.6.3系统发育进化树的构建5
2实验结果与分析5
2.1麦麸中乳酸菌的分离5
2.2分离菌株的初步鉴定6
2.3葡萄糖产酸产气实验结果9
2.4抑霉菌乳酸菌的筛选结果9
2.5菌株 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072^
16S rDNA 序列 PCR 扩增结果11
2.6同源性分析与鉴定结果12
2.7系统发育进化树13
3总结13
致谢14
参考文献14
麦麸中抗真菌活性乳酸菌的筛选、鉴定
引言
中国的小麦产量很高，是世界重要的小麦出口国之一。在中国，小麦是大多数北方人的重要食材，小麦可以加工成面粉，进而制成馒头、面条等主食。小麦的加工会得到许多麦麸，过去人们将其作为柴火或者废料使用。一些科学家对麦麸进行研究发现，麦麸由许多膳食纤维、维生素、脂肪以及蛋白质构成，有极高的营养价值。除此之外，麦麸还含有丰富的生理活性物质，比如：黄酮类化合物，这些生理活性物质具有良好的抗肿瘤以及抗氧化作用[1]。调查数据显示，中国每年的麦麸产量达到20000000吨，有着十分丰富的麦麸资源。然而，这些麦麸并没有得到充分的利用，是一种资源浪费[2]。让小麦麦麸进行自然发酵，分类筛选出最优的抗真菌的乳酸菌，为后期提高麦麸中营养物质的提取率，用固态发酵麦麸的方法来改善麦麸的营养成分和口感风味等研究打下基础，有利于提升麦麸的利用价值而减少麦麸的浪费。
在食品发酵过程中，乳酸菌可以使食物产生独特的结构，给人以特别的口感与味道，得到了许多人的喜爱。事实上，乳酸菌在食品发酵时还可以产生有机酸以及细菌素等抑菌物质，具有一定的防腐作用，并且这种防腐作用没有任何的副反应，不会对人体产生损害。由于乳酸菌能够安全防腐，许多学者对乳酸菌展开了研究[3]。笔者查阅相关资料了解到，目前的乳酸菌主要有23个属[4]。现阶段对乳酸菌的分类与鉴定主要依据其形态特征与生化、生理性状[5]。近年来，为提高分类鉴定的准确性与效率，许多专家和学者通过一系列的研究提出了许多新技术与研究方法[6]。16SrDNA序列分析是乳酸菌的系统发育的重要内容[7]。笔者就是依据这些菌种的形态特点、生化和生理性状特点以及分子生物学16S rDNA序列分析进行鉴定。
笔者查阅相关资料了解到，世界各国的学者都对乳酸菌的抗真菌特性展开了研究与分析，Maing等人[8]通过一系列的实验分析说明了乳酸菌可以影响黄曲霉毒素的产量。石金鑫[9]对抗霉菌进行了有针对性的研究，从朝鲜泡菜以及东北酸菜中筛选出能够显著拮抗黑曲霉以及扩展青霉的菌株。本文选取麦麸作为研究对象，计划使麦麸自然发酵，从中筛选出能够显著拮抗黄曲霉、黑曲霉以及禾谷镰刀菌的菌株，并将其作为菌源，用于筛选抗真菌乳酸菌。
材料与方法
1.1材料与试剂
蛋白酶K（Sigma）；过氧化氢酶（CAT，Sigma）；凝胶回收试剂盒（Gel Extraction Kit，TaKaRa）；Taq DNA聚合酶（Thermusaquaticus ，TaKaRa）；细菌基因组提取试剂盒（Bacterial DNA Kit（200），OMEGA）；杭州百思生物技术企业的革兰氏染色试剂盒；江苏购买的麦麸；以及其他相关的市售分析纯试剂。
1.2菌种及主要培养基
指示菌：黄曲霉（Aspergillus flavus）、黑曲霉（Aspergillus Niger）以及禾谷镰刀菌（Fusarium graminearum）。
PDA琼脂培养基：自然PH条件，1升蒸馏水，20克葡萄糖，1520克琼脂以及200克马铃薯。
MRS培养基: 1升蒸馏水，1毫升吐温80, 0.05克硫酸锰，0.1克硫酸镁，柠檬酸铵和硫酸氢二钾各2克，5克醋酸钠，20克葡萄糖，5克酵母浸出汁，牛肉膏和蛋白胨各10克。将pH调至6.06.4，并于 115 ℃条件下灭菌20分钟。
1.3主要仪器与设备
超净工作台(SWCJU)：苏州安泰公司(地址：苏州)；
高压蒸汽灭菌锅：北京发恩科贸有限公司（北京）；
电子天平(AY120)：日本岛津公司（上海）；
pH 计(Orion Star)：美国Thermo公司（上海）；
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1 材料与方法2
1.1 材料与试剂 2
1.2菌种及主要培养基2
1.3主要仪器与设备2
1.4实验方法2
1.4.1样品的采集及处理2
1.4.2乳酸菌的分离纯化3
1.4.3革兰氏染色、过氧化氢酶试验及菌落形态观察3
1.4.4葡萄糖产酸产气实验3
1.4.5抑霉菌乳酸菌的筛选3
1.4.6菌株16SrDNA鉴定4
1.4.6.1菌株基因组 DNA 提取4
1.4.6.2 PCR 扩增 16S rDNA 序列4
1.4.6.3系统发育进化树的构建5
2实验结果与分析5
2.1麦麸中乳酸菌的分离5
2.2分离菌株的初步鉴定6
2.3葡萄糖产酸产气实验结果9
2.4抑霉菌乳酸菌的筛选结果9
2.5菌株 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072^
16S rDNA 序列 PCR 扩增结果11
2.6同源性分析与鉴定结果12
2.7系统发育进化树13
3总结13
致谢14
参考文献14
麦麸中抗真菌活性乳酸菌的筛选、鉴定
引言
中国的小麦产量很高，是世界重要的小麦出口国之一。在中国，小麦是大多数北方人的重要食材，小麦可以加工成面粉，进而制成馒头、面条等主食。小麦的加工会得到许多麦麸，过去人们将其作为柴火或者废料使用。一些科学家对麦麸进行研究发现，麦麸由许多膳食纤维、维生素、脂肪以及蛋白质构成，有极高的营养价值。除此之外，麦麸还含有丰富的生理活性物质，比如：黄酮类化合物，这些生理活性物质具有良好的抗肿瘤以及抗氧化作用[1]。调查数据显示，中国每年的麦麸产量达到20000000吨，有着十分丰富的麦麸资源。然而，这些麦麸并没有得到充分的利用，是一种资源浪费[2]。让小麦麦麸进行自然发酵，分类筛选出最优的抗真菌的乳酸菌，为后期提高麦麸中营养物质的提取率，用固态发酵麦麸的方法来改善麦麸的营养成分和口感风味等研究打下基础，有利于提升麦麸的利用价值而减少麦麸的浪费。
在食品发酵过程中，乳酸菌可以使食物产生独特的结构，给人以特别的口感与味道，得到了许多人的喜爱。事实上，乳酸菌在食品发酵时还可以产生有机酸以及细菌素等抑菌物质，具有一定的防腐作用，并且这种防腐作用没有任何的副反应，不会对人体产生损害。由于乳酸菌能够安全防腐，许多学者对乳酸菌展开了研究[3]。笔者查阅相关资料了解到，目前的乳酸菌主要有23个属[4]。现阶段对乳酸菌的分类与鉴定主要依据其形态特征与生化、生理性状[5]。近年来，为提高分类鉴定的准确性与效率，许多专家和学者通过一系列的研究提出了许多新技术与研究方法[6]。16SrDNA序列分析是乳酸菌的系统发育的重要内容[7]。笔者就是依据这些菌种的形态特点、生化和生理性状特点以及分子生物学16S rDNA序列分析进行鉴定。
笔者查阅相关资料了解到，世界各国的学者都对乳酸菌的抗真菌特性展开了研究与分析，Maing等人[8]通过一系列的实验分析说明了乳酸菌可以影响黄曲霉毒素的产量。石金鑫[9]对抗霉菌进行了有针对性的研究，从朝鲜泡菜以及东北酸菜中筛选出能够显著拮抗黑曲霉以及扩展青霉的菌株。本文选取麦麸作为研究对象，计划使麦麸自然发酵，从中筛选出能够显著拮抗黄曲霉、黑曲霉以及禾谷镰刀菌的菌株，并将其作为菌源，用于筛选抗真菌乳酸菌。
材料与方法
1.1材料与试剂
蛋白酶K（Sigma）；过氧化氢酶（CAT，Sigma）；凝胶回收试剂盒（Gel Extraction Kit，TaKaRa）；Taq DNA聚合酶（Thermusaquaticus ，TaKaRa）；细菌基因组提取试剂盒（Bacterial DNA Kit（200），OMEGA）；杭州百思生物技术企业的革兰氏染色试剂盒；江苏购买的麦麸；以及其他相关的市售分析纯试剂。
1.2菌种及主要培养基
指示菌：黄曲霉（Aspergillus flavus）、黑曲霉（Aspergillus Niger）以及禾谷镰刀菌（Fusarium graminearum）。
PDA琼脂培养基：自然PH条件，1升蒸馏水，20克葡萄糖，1520克琼脂以及200克马铃薯。
MRS培养基: 1升蒸馏水，1毫升吐温80, 0.05克硫酸锰，0.1克硫酸镁，柠檬酸铵和硫酸氢二钾各2克，5克醋酸钠，20克葡萄糖，5克酵母浸出汁，牛肉膏和蛋白胨各10克。将pH调至6.06.4，并于 115 ℃条件下灭菌20分钟。
1.3主要仪器与设备
超净工作台(SWCJU)：苏州安泰公司(地址：苏州)；
高压蒸汽灭菌锅：北京发恩科贸有限公司（北京）；
电子天平(AY120)：日本岛津公司（上海）；
pH 计(Orion Star)：美国Thermo公司（上海）；
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