鱼粉蛋白酶解制备肽的工艺研究
鱼粉蛋白酶解制备肽的工艺研究[20200408175250]
摘 要
鱼粉是以低值鱼类为原料，通过脱油、脱水和加工磨制后的高蛋白饲料。长期以来，这些低值鱼的营养价值和应用前景并未得到充分认识，造成大量蛋白资源利用率低，甚至流失。
本实验以国产鱼粉为原料，选用四种不同的蛋白酶即中性蛋白酶、复合蛋白酶、碱性蛋白酶和风味蛋白酶对其进行酶解。以水解度为指标，确定对鱼粉蛋白酶解效果最佳的酶，并对其水解参数进行了优化。实验结果表明，碱性蛋白酶Alcalase 2.4L对鱼粉的水解效果最佳，料水比、酶量、pH、水解时间和温度对鱼粉水解均有影响。通过响应面法确定最佳酶解工艺参数为：料水比1:10、加酶量5g/100g、pH9.0、温度50 ℃时水解5h，鱼粉蛋白的水解度可达到23.95 %，重复实验水解度在23 %以上。在此条件下，酶解所得低聚肽含量为55%左右，酶解产物的相对分子质量均低于1400Da。
*查看完整论文请 +Q: 3 5 1 9 1 6 0 7 2
关键字:鱼粉蛋白质碱性蛋白酶水解度酶解工艺
目录
1.前言 1
1.1.肽的制备技术 1
1.1.1 化学法水解 1
1.1.2 生化法水解 1
1.1.3合成法 2
1.2.酶解法制备水产生物活性肽的研究进展 2
1.2.1抗氧化水产生物活性肽 2
1.2.2抗肿瘤水产生物活性肽 2
1.2.3降血压及调血脂水产生物活性肽 3
1.2.4其他功能水产生物活性肽 3
1.3.生物活性肽的前景与展望 3
1.4.鱼粉的研究现状 3
1.4.1鱼粉对鱼类生长的影响 3
1.4.2鱼粉新鲜度对虾类生长的影响 4
1.4.3鱼粉对贝类生长的影响 4
2. 材料与方法 4
2.1 材料与试剂 4
2.2 实验仪器 4
2.3 实验方法 5
2.3.1 粗蛋白含量测定 5
2.3.2 蛋白酶活力测定 5
2.3.3 氨基态氮的测定 5
2.3.4水解度（DH）的测定 5
2.3.5 鱼粉蛋白酶解流程 5
2.3.6 碱性蛋白酶酶解工艺 5
2.3.7 酶解产物的相对分子质量分布测定 6
3. 结果与分析 6
3.1 最佳蛋白酶的选择 6
3.2 影响鱼粉蛋白酶解因素 7
3.2.1 料水比对鱼粉蛋白水解度的影响 7
3.2.2 酶量对鱼粉蛋白水解度的影响 7
3.2.3 pH值对鱼粉蛋白水解度的影响 8
3.2.4酶解时间对鱼粉蛋白水解度的影响 9
3.2.5 温度对鱼粉蛋白水解度的影响 10
3.3 响应面优化酶解条件 10
3.4 酶解产物的相对分子质量分布 15
4. 结论 15
参考文献 16
致谢 18
1.前言
肽主要分为两种，一种是机体直接表达、有特别生理学需要的天然短肽或不完全水解的天然蛋白质产生的各种不同长度的肽段，这些水解产生的短肽可能具有某些特殊生理功能，然而其前体却没有。这些有特殊的生理活性的肽类即为生物活性肽[1]。另一种称为非活性肽，其在体内只起到氨基酸营养源的作用[2]。
生物活性肽的生物学意义着重表现在两个方面：比氨基酸强的吸收机制与拥有氨基酸无法比较的生理功能[3]。活性肽具有调节多种机体代谢和生理变化的功能，易消化吸收，能加强免疫，调节激素，有抗菌、抗病毒、降血压和降血脂等功能，其有很高的安全性，是目前一个非常有前景的国际食品功能因子的研究热点。
1.1.肽的制备技术
1.1.1 化学法水解
化学法水解蛋白主要通过酸或碱裂解肽键实现，生产工艺已经相当成熟[4]。化学法操作简单，成本低廉。但是化学法水解蛋白难以控制，酶解产物中含有多种化学成分，且功能活性复杂[5]。同时，使用强酸、强碱水解蛋白质时，通常形成极端的温度和pH 环境，容易导致酶解产物丧失功能活性，降低品质，无法用作增味剂[6]。
1.1.2 生化法水解
生化法利用水产品体内本身就有的内源性蛋白酶的自溶水解来水解肽键，进而对对鱼或其他水产来源的蛋白进行水解，或者通过加入其他来源的蛋白酶对其进行水解。
①自溶水解
水产蛋白自溶水解的作用，基本由其自身消化酶产生，这些酶包括胰酶、胰凝乳蛋白酶和胃蛋白酶等等。在一定程度上，溶酶体和细胞自溶酵素也有助于蛋白的降解。蛋白的自溶水解是过程简单，不涉及工具酶的成本，其终产物一般是含有丰富游离氨基酸和小肽的粘稠液体。但是，内源蛋白酶也可能随季节变化有很大的差异。因此，水产蛋白的自溶过程基本无法被控制[7]。
②其他来源蛋白酶水解
酶解法是指利用蛋白酶对水产蛋白肽链的剪切作用，使其蕴含的具有潜在功能性的肽段得以释放，从而获得具有特定活性的功能肽。与其他制备方法相比，酶解法具有安全、高效、无污染、生产成本低等优点，因此更受人们青睐[8]。
1.1.3合成法
合成法是指运用DNA重组技术或化学方法等定向合成生物活性肽，当前该法只限于合成分子量比较小且结构比较简单的肽类化合物，与此同时此法投资大、成本高[8]。
我国在研究开发水产生物活性肽领域中主要采用酶解法，现利用风味蛋白酶、胰蛋白酶和胃蛋白酶等酶制剂已经从水产品中制备出了多种具有生物活性的肽类物质[9-11]。
1.2.酶解法制备水产生物活性肽的研究进展
1.2.1抗氧化水产生物活性肽
研究表明，人类有相当多的疾病，如衰老、肿瘤、动脉硬化等疾病均由自由基所引起。而天然抗氧化剂是一种良好的自由基清除剂，因此研究生物技术制备抗氧化生物活性肽已经是目前食品行业的热点[12-13]。
大量研究证明，运用酶解技术能从水产蛋白中制取抗氧化肽。目前，在这方面，我国已获得了不错的进展。赵谋明[14]等发现海洋低值鱼蓝园鲹的酶解物具有抗氧化活性，并对酶解产物的抗氧化稳定性进行了研究。研究结果表明，在酸性条境下，蓝园鲹抗氧化肽热稳定性较好，活性保持率也比在碱性环境下高。此外，国内学者还从草鱼、泥鳅蛋白酶解物中分离富集出具有高活性的抗氧化肽，其肽链结构分别为Pro-Ser-Lys-Tyr-Glu-Pro-Phe-Val（966.3u）和Pro-Ser-Tyr-Val（464.2u）[15-16]。除鱼肉蛋白源外，国内研究还利用酶解法从贝类、藻类等水产蛋白中制备得到抗氧化肽[17-18]。
1.2.2抗肿瘤水产生物活性肽
在酶解法制备抗肿瘤水产生物活性肽的研究方面，国外报道鱼类及无脊椎水产动物的酶解产物对肿瘤及癌细胞的增殖具有明显的抑制作用。在该领域，我国也开展了相关研究。洪鹏志等选用枯草杆菌中性蛋白酶与胃蛋白酶对翡翠贻贝肉进行复合水解，并经小鼠实验分析了酶解产物的抗肿瘤活性。实验结果显示，当翡翠贻贝肉酶解物达到320mg/kg体重时，其对昆明小鼠移植性肿瘤S180的抑瘤率为50.6%[8]。
1.2.3降血压及调血脂水产生物活性肽
如今，研究探寻及开发安全、无副作用的天然降血压产物已变为国内外的重点。我国在该领域的研究较多，陈胜军[19]等以罗非鱼鱼皮作原料，选用菠萝蛋白酶和碱性蛋白酶对其进行复合酶解。研究发现，所得酶解产物经柱层析纯化后其对ACE的半抑制浓度IC50为0.65mg/mL。毋瑾超等利用复合生物酶水解鲢鱼肉制备得到对自发性高血压大鼠有显著疗效的降血压肽，并探明其相对分子质量小于1600u，疏水性氨基酸含量约为24.86%[8]。
1.2.4其他功能水产生物活性肽
除上述功能性肽外，李琳等还利用控制酶解技术从鳙鱼肉蛋白中制备得到具有抗衰老和免疫调节作用的鳙鱼肽。刘海英等利用酶解法从斑点叉尾鮰鱼皮中制得一种胶原蛋白肽，其能够降低小鼠皮肤光老化作用。裴新荣等以深海鲑鱼鱼皮为原料，通过对其进行复合偶联酶解制得具有抑制小鼠学习记忆功能下降的海洋胶原肽[9]。
1.3.生物活性肽的前景与展望
摘 要
鱼粉是以低值鱼类为原料，通过脱油、脱水和加工磨制后的高蛋白饲料。长期以来，这些低值鱼的营养价值和应用前景并未得到充分认识，造成大量蛋白资源利用率低，甚至流失。
本实验以国产鱼粉为原料，选用四种不同的蛋白酶即中性蛋白酶、复合蛋白酶、碱性蛋白酶和风味蛋白酶对其进行酶解。以水解度为指标，确定对鱼粉蛋白酶解效果最佳的酶，并对其水解参数进行了优化。实验结果表明，碱性蛋白酶Alcalase 2.4L对鱼粉的水解效果最佳，料水比、酶量、pH、水解时间和温度对鱼粉水解均有影响。通过响应面法确定最佳酶解工艺参数为：料水比1:10、加酶量5g/100g、pH9.0、温度50 ℃时水解5h，鱼粉蛋白的水解度可达到23.95 %，重复实验水解度在23 %以上。在此条件下，酶解所得低聚肽含量为55%左右，酶解产物的相对分子质量均低于1400Da。
*查看完整论文请 +Q: 3 5 1 9 1 6 0 7 2
关键字:鱼粉蛋白质碱性蛋白酶水解度酶解工艺
目录
1.前言 1
1.1.肽的制备技术 1
1.1.1 化学法水解 1
1.1.2 生化法水解 1
1.1.3合成法 2
1.2.酶解法制备水产生物活性肽的研究进展 2
1.2.1抗氧化水产生物活性肽 2
1.2.2抗肿瘤水产生物活性肽 2
1.2.3降血压及调血脂水产生物活性肽 3
1.2.4其他功能水产生物活性肽 3
1.3.生物活性肽的前景与展望 3
1.4.鱼粉的研究现状 3
1.4.1鱼粉对鱼类生长的影响 3
1.4.2鱼粉新鲜度对虾类生长的影响 4
1.4.3鱼粉对贝类生长的影响 4
2. 材料与方法 4
2.1 材料与试剂 4
2.2 实验仪器 4
2.3 实验方法 5
2.3.1 粗蛋白含量测定 5
2.3.2 蛋白酶活力测定 5
2.3.3 氨基态氮的测定 5
2.3.4水解度（DH）的测定 5
2.3.5 鱼粉蛋白酶解流程 5
2.3.6 碱性蛋白酶酶解工艺 5
2.3.7 酶解产物的相对分子质量分布测定 6
3. 结果与分析 6
3.1 最佳蛋白酶的选择 6
3.2 影响鱼粉蛋白酶解因素 7
3.2.1 料水比对鱼粉蛋白水解度的影响 7
3.2.2 酶量对鱼粉蛋白水解度的影响 7
3.2.3 pH值对鱼粉蛋白水解度的影响 8
3.2.4酶解时间对鱼粉蛋白水解度的影响 9
3.2.5 温度对鱼粉蛋白水解度的影响 10
3.3 响应面优化酶解条件 10
3.4 酶解产物的相对分子质量分布 15
4. 结论 15
参考文献 16
致谢 18
1.前言
肽主要分为两种，一种是机体直接表达、有特别生理学需要的天然短肽或不完全水解的天然蛋白质产生的各种不同长度的肽段，这些水解产生的短肽可能具有某些特殊生理功能，然而其前体却没有。这些有特殊的生理活性的肽类即为生物活性肽[1]。另一种称为非活性肽，其在体内只起到氨基酸营养源的作用[2]。
生物活性肽的生物学意义着重表现在两个方面：比氨基酸强的吸收机制与拥有氨基酸无法比较的生理功能[3]。活性肽具有调节多种机体代谢和生理变化的功能，易消化吸收，能加强免疫，调节激素，有抗菌、抗病毒、降血压和降血脂等功能，其有很高的安全性，是目前一个非常有前景的国际食品功能因子的研究热点。
1.1.肽的制备技术
1.1.1 化学法水解
化学法水解蛋白主要通过酸或碱裂解肽键实现，生产工艺已经相当成熟[4]。化学法操作简单，成本低廉。但是化学法水解蛋白难以控制，酶解产物中含有多种化学成分，且功能活性复杂[5]。同时，使用强酸、强碱水解蛋白质时，通常形成极端的温度和pH 环境，容易导致酶解产物丧失功能活性，降低品质，无法用作增味剂[6]。
1.1.2 生化法水解
生化法利用水产品体内本身就有的内源性蛋白酶的自溶水解来水解肽键，进而对对鱼或其他水产来源的蛋白进行水解，或者通过加入其他来源的蛋白酶对其进行水解。
①自溶水解
水产蛋白自溶水解的作用，基本由其自身消化酶产生，这些酶包括胰酶、胰凝乳蛋白酶和胃蛋白酶等等。在一定程度上，溶酶体和细胞自溶酵素也有助于蛋白的降解。蛋白的自溶水解是过程简单，不涉及工具酶的成本，其终产物一般是含有丰富游离氨基酸和小肽的粘稠液体。但是，内源蛋白酶也可能随季节变化有很大的差异。因此，水产蛋白的自溶过程基本无法被控制[7]。
②其他来源蛋白酶水解
酶解法是指利用蛋白酶对水产蛋白肽链的剪切作用，使其蕴含的具有潜在功能性的肽段得以释放，从而获得具有特定活性的功能肽。与其他制备方法相比，酶解法具有安全、高效、无污染、生产成本低等优点，因此更受人们青睐[8]。
1.1.3合成法
合成法是指运用DNA重组技术或化学方法等定向合成生物活性肽，当前该法只限于合成分子量比较小且结构比较简单的肽类化合物，与此同时此法投资大、成本高[8]。
我国在研究开发水产生物活性肽领域中主要采用酶解法，现利用风味蛋白酶、胰蛋白酶和胃蛋白酶等酶制剂已经从水产品中制备出了多种具有生物活性的肽类物质[9-11]。
1.2.酶解法制备水产生物活性肽的研究进展
1.2.1抗氧化水产生物活性肽
研究表明，人类有相当多的疾病，如衰老、肿瘤、动脉硬化等疾病均由自由基所引起。而天然抗氧化剂是一种良好的自由基清除剂，因此研究生物技术制备抗氧化生物活性肽已经是目前食品行业的热点[12-13]。
大量研究证明，运用酶解技术能从水产蛋白中制取抗氧化肽。目前，在这方面，我国已获得了不错的进展。赵谋明[14]等发现海洋低值鱼蓝园鲹的酶解物具有抗氧化活性，并对酶解产物的抗氧化稳定性进行了研究。研究结果表明，在酸性条境下，蓝园鲹抗氧化肽热稳定性较好，活性保持率也比在碱性环境下高。此外，国内学者还从草鱼、泥鳅蛋白酶解物中分离富集出具有高活性的抗氧化肽，其肽链结构分别为Pro-Ser-Lys-Tyr-Glu-Pro-Phe-Val（966.3u）和Pro-Ser-Tyr-Val（464.2u）[15-16]。除鱼肉蛋白源外，国内研究还利用酶解法从贝类、藻类等水产蛋白中制备得到抗氧化肽[17-18]。
1.2.2抗肿瘤水产生物活性肽
在酶解法制备抗肿瘤水产生物活性肽的研究方面，国外报道鱼类及无脊椎水产动物的酶解产物对肿瘤及癌细胞的增殖具有明显的抑制作用。在该领域，我国也开展了相关研究。洪鹏志等选用枯草杆菌中性蛋白酶与胃蛋白酶对翡翠贻贝肉进行复合水解，并经小鼠实验分析了酶解产物的抗肿瘤活性。实验结果显示，当翡翠贻贝肉酶解物达到320mg/kg体重时，其对昆明小鼠移植性肿瘤S180的抑瘤率为50.6%[8]。
1.2.3降血压及调血脂水产生物活性肽
如今，研究探寻及开发安全、无副作用的天然降血压产物已变为国内外的重点。我国在该领域的研究较多，陈胜军[19]等以罗非鱼鱼皮作原料，选用菠萝蛋白酶和碱性蛋白酶对其进行复合酶解。研究发现，所得酶解产物经柱层析纯化后其对ACE的半抑制浓度IC50为0.65mg/mL。毋瑾超等利用复合生物酶水解鲢鱼肉制备得到对自发性高血压大鼠有显著疗效的降血压肽，并探明其相对分子质量小于1600u，疏水性氨基酸含量约为24.86%[8]。
1.2.4其他功能水产生物活性肽
除上述功能性肽外，李琳等还利用控制酶解技术从鳙鱼肉蛋白中制备得到具有抗衰老和免疫调节作用的鳙鱼肽。刘海英等利用酶解法从斑点叉尾鮰鱼皮中制得一种胶原蛋白肽，其能够降低小鼠皮肤光老化作用。裴新荣等以深海鲑鱼鱼皮为原料，通过对其进行复合偶联酶解制得具有抑制小鼠学习记忆功能下降的海洋胶原肽[9]。
1.3.生物活性肽的前景与展望
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