四环素解构酶的异源表达与功能分析
目前，耐药基因作为一种新型的环境污染物被越来越多地关注，四环素耐药基因是其中重要的一类，因此对四环素耐药机制的研究有着重要的意义。本课题利用在珠穆朗玛峰土壤宏基因组文库中筛选出的四环素抗性基因MQTet1435进行克隆、异源表达蛋白并纯化，并检测纯化蛋白的体外活性，结果表明MQTet1435是一种新的四环素抗性基因，编码四环素解构酶MQTet1435，该酶通过改变四环素的化学结构使四环素失去药性。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1 材料与方法2
1.1 材料 2
1.1.1 菌株来源2
1.1.2 引物设计2
1.1.3 主要仪器和设备2
1.1.4 主要试剂、培养基和溶液3
1.2 方法3
1.2.1 PCR引物设计与合成3
1.2.2 MQTet1435阳性亚克隆质粒提取3
1.2.3 MQTet1435基因PCR扩增4
1.2.4 琼脂糖凝胶电泳4
1.2.5 琼脂糖凝胶DNA回收4
1.2.6 载体pET30a和PCR产物双酶切5
1.2.7功能基因表达载体重组子构建5
1.2.8功能基因表达载体重组子脱盐5
1.2.9 功能基因表达载体重组子电转化5
1.2.10原核重组子测序5
1.2.11 MQTet1435蛋白的原核表达5
1.2.12 MQTet1435蛋白的纯化6
1.2.13 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳检测纯化蛋白6
1.2.14 MQTet1435蛋白的体外活性实验6
2 结果与分析6
2.1 引物设计6
2.2 四环素解构酶基因MQTet1435的克隆7
2.3 MQTet1435蛋白的表达与纯化8
2.4 MQTet1435蛋白的体外功能活性实验9
3 讨论10
致谢11
参考文献11
图21 四环素解构酶 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: *351916072*
MQTet1435与Tet49和TetX氨基酸序列比对7
图22 MQTet1435 PCR扩增产物8
图23 pET30a(+)酶切胶回收产物8
图24 功能基因表达载体重组子Nde I和Xho I酶切产物8
图25 诱导各阶段蛋白SDSPAGE8
图26 反向HPLC分离四环素和酶分解产物（260nm）9
表11 引物名称及序列3
表12 PCR反应体系4
表13 载体pET30a和PCR产物双酶切体系3
表14 功能基因表达载体重组子构建连接体系3
表15 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳3
表21 特异性引物名称及序列3
四环素解构酶的异源表达与功能分析
食品质量与安全学生 赵妍
引言
四环素属于四环素类抗生素，是一种低毒、高效而又价格低廉的广谱抗生素。四环素能够通过细菌细胞膜进入细胞质，以阳离子—四环素复合物的形式特异性地与核糖体30S亚基上的A位点结合，阻止氨基酸与tRNA在该位点结合，从而抑制肽链的延伸和蛋白质的合成，影响细菌的正常生长，起到抑菌的作用。除了抑菌的优良效果，研究人员还发现了四环素的许多非抗生素作用，例如清除自由基、诊断恶性肿瘤等[1]。正是由于低廉而又高效的优点，四环素被广泛应用于临床医学及动物养殖。
细菌为了能够在自然界激烈的竞争中存活下来，逐渐演化出对某些恶劣环境的适应能力，对抗生素的耐受是其中的一种。广泛地使用抗生素，使得对抗生素敏感的菌株不断被杀灭，剩余的少部分能够耐抗生素的菌株得以大量繁殖。随着时间的推移，这一过程被不断强化，最终导致耐药细菌的数量逐年增长，细菌的耐药能力也逐渐加强，四环素也不例外。张俊等[2]调查发现，在长期施用四环素残留猪粪的土壤中，四环素耐药菌的基因组DNA上抗性基因检出率为100%，质粒DNA上检出率为95.7%，而未施用四环素残留猪粪的土壤四环素耐药菌基因组DNA和质粒DNA均未检出抗性基因，证明了土壤中四环素残留量与抗性基因的增长存在显著的相关性。目前，环境中的四环素残留很严重，四环素抗性基因的增长速度可能会加快。因此，研究四环素的耐药机制，找到能够控制耐药性继续发展的方法显得尤为重要。
早在1964年，S. Okamoto和D. Mizuno等[3]就发现大肠杆菌耐四环素菌株具有耐药性是由于细胞对四环素的渗透率降低。20世纪80年代，Mendez和Marshall等人[4]先后发现了5种四环素外排泵蛋白（Efflux protein）Tet（AE），将四环素耐药机制的研究带入了分子时代。随后，更多的四环素耐药基因被发现，除了具有外排泵作用外，还有保护核糖体和解构四环素等作用[5,6]。
目前为止，报道的编码四环素外排泵蛋白的基因已超过30个。外排泵蛋白存在于细菌细胞膜的磷脂双分子层中，以亲水氨基酸环的形式延伸到细胞质和周质空间中，逆浓度梯度将阳离子—四环素复合物泵出胞外[6]。另外，报道的编码核糖体保护蛋白的基因已超过10个，其中Tet(M)和Tet(O)这两个蛋白被研究最透彻。核糖体保护蛋白具有核糖体依赖的GTP水解酶活性[7,8]，它与核糖体结合并催化GTP水解，为核糖体构型变化供能，核糖体构型改变后，四环素不能与核糖体结合，因此不具备阻止蛋白合成的作用[8,9]，从而使细菌对四环素耐受。
与上述四环素外排泵和核糖体保护这两种耐药机制的研究相比，关于四环素解构这一耐药机制的相关报道甚少。根据报道，目前能够确定功能的四环素解构酶只有1个，即TetX。TetX蛋白由388个氨基酸组成，分子量为43.7 kDa。Yang等人[10]发现TetX是一种黄素单加氧酶，以FAD为辅酶。该酶在厌氧的条件下也能被合成，但是只有在O2和NADPH同时存在时才能表现解构四环素的特性，并且在pH 8.5时解构四环素的活性最高[10,11]。此外，Forsgerg等人[12] 从土壤样本中筛选出一组能够高水平表达四环素抗性的基因，这些基因能够编码解构四环素的蛋白，但是编码的蛋白与TetX的氨基酸同源性最多只有24.4%。对这几种蛋白做体外反应实验，HPLC结果显示有部分蛋白催化的反应与TetX催化的反应不同，表明可能有不同于四环素解构酶TetX的机制来分解四环素，但目前这种机制还没有被研究透彻。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1 材料与方法2
1.1 材料 2
1.1.1 菌株来源2
1.1.2 引物设计2
1.1.3 主要仪器和设备2
1.1.4 主要试剂、培养基和溶液3
1.2 方法3
1.2.1 PCR引物设计与合成3
1.2.2 MQTet1435阳性亚克隆质粒提取3
1.2.3 MQTet1435基因PCR扩增4
1.2.4 琼脂糖凝胶电泳4
1.2.5 琼脂糖凝胶DNA回收4
1.2.6 载体pET30a和PCR产物双酶切5
1.2.7功能基因表达载体重组子构建5
1.2.8功能基因表达载体重组子脱盐5
1.2.9 功能基因表达载体重组子电转化5
1.2.10原核重组子测序5
1.2.11 MQTet1435蛋白的原核表达5
1.2.12 MQTet1435蛋白的纯化6
1.2.13 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳检测纯化蛋白6
1.2.14 MQTet1435蛋白的体外活性实验6
2 结果与分析6
2.1 引物设计6
2.2 四环素解构酶基因MQTet1435的克隆7
2.3 MQTet1435蛋白的表达与纯化8
2.4 MQTet1435蛋白的体外功能活性实验9
3 讨论10
致谢11
参考文献11
图21 四环素解构酶 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: *351916072*
MQTet1435与Tet49和TetX氨基酸序列比对7
图22 MQTet1435 PCR扩增产物8
图23 pET30a(+)酶切胶回收产物8
图24 功能基因表达载体重组子Nde I和Xho I酶切产物8
图25 诱导各阶段蛋白SDSPAGE8
图26 反向HPLC分离四环素和酶分解产物（260nm）9
表11 引物名称及序列3
表12 PCR反应体系4
表13 载体pET30a和PCR产物双酶切体系3
表14 功能基因表达载体重组子构建连接体系3
表15 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳3
表21 特异性引物名称及序列3
四环素解构酶的异源表达与功能分析
食品质量与安全学生 赵妍
引言
四环素属于四环素类抗生素，是一种低毒、高效而又价格低廉的广谱抗生素。四环素能够通过细菌细胞膜进入细胞质，以阳离子—四环素复合物的形式特异性地与核糖体30S亚基上的A位点结合，阻止氨基酸与tRNA在该位点结合，从而抑制肽链的延伸和蛋白质的合成，影响细菌的正常生长，起到抑菌的作用。除了抑菌的优良效果，研究人员还发现了四环素的许多非抗生素作用，例如清除自由基、诊断恶性肿瘤等[1]。正是由于低廉而又高效的优点，四环素被广泛应用于临床医学及动物养殖。
细菌为了能够在自然界激烈的竞争中存活下来，逐渐演化出对某些恶劣环境的适应能力，对抗生素的耐受是其中的一种。广泛地使用抗生素，使得对抗生素敏感的菌株不断被杀灭，剩余的少部分能够耐抗生素的菌株得以大量繁殖。随着时间的推移，这一过程被不断强化，最终导致耐药细菌的数量逐年增长，细菌的耐药能力也逐渐加强，四环素也不例外。张俊等[2]调查发现，在长期施用四环素残留猪粪的土壤中，四环素耐药菌的基因组DNA上抗性基因检出率为100%，质粒DNA上检出率为95.7%，而未施用四环素残留猪粪的土壤四环素耐药菌基因组DNA和质粒DNA均未检出抗性基因，证明了土壤中四环素残留量与抗性基因的增长存在显著的相关性。目前，环境中的四环素残留很严重，四环素抗性基因的增长速度可能会加快。因此，研究四环素的耐药机制，找到能够控制耐药性继续发展的方法显得尤为重要。
早在1964年，S. Okamoto和D. Mizuno等[3]就发现大肠杆菌耐四环素菌株具有耐药性是由于细胞对四环素的渗透率降低。20世纪80年代，Mendez和Marshall等人[4]先后发现了5种四环素外排泵蛋白（Efflux protein）Tet（AE），将四环素耐药机制的研究带入了分子时代。随后，更多的四环素耐药基因被发现，除了具有外排泵作用外，还有保护核糖体和解构四环素等作用[5,6]。
目前为止，报道的编码四环素外排泵蛋白的基因已超过30个。外排泵蛋白存在于细菌细胞膜的磷脂双分子层中，以亲水氨基酸环的形式延伸到细胞质和周质空间中，逆浓度梯度将阳离子—四环素复合物泵出胞外[6]。另外，报道的编码核糖体保护蛋白的基因已超过10个，其中Tet(M)和Tet(O)这两个蛋白被研究最透彻。核糖体保护蛋白具有核糖体依赖的GTP水解酶活性[7,8]，它与核糖体结合并催化GTP水解，为核糖体构型变化供能，核糖体构型改变后，四环素不能与核糖体结合，因此不具备阻止蛋白合成的作用[8,9]，从而使细菌对四环素耐受。
与上述四环素外排泵和核糖体保护这两种耐药机制的研究相比，关于四环素解构这一耐药机制的相关报道甚少。根据报道，目前能够确定功能的四环素解构酶只有1个，即TetX。TetX蛋白由388个氨基酸组成，分子量为43.7 kDa。Yang等人[10]发现TetX是一种黄素单加氧酶，以FAD为辅酶。该酶在厌氧的条件下也能被合成，但是只有在O2和NADPH同时存在时才能表现解构四环素的特性，并且在pH 8.5时解构四环素的活性最高[10,11]。此外，Forsgerg等人[12] 从土壤样本中筛选出一组能够高水平表达四环素抗性的基因，这些基因能够编码解构四环素的蛋白，但是编码的蛋白与TetX的氨基酸同源性最多只有24.4%。对这几种蛋白做体外反应实验，HPLC结果显示有部分蛋白催化的反应与TetX催化的反应不同，表明可能有不同于四环素解构酶TetX的机制来分解四环素，但目前这种机制还没有被研究透彻。
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