土壤宏基因组文库中四环素耐药基因的筛选
摘要：抗生素可以是某些微生物生长繁殖过程中产生的一种物质,可以有效杀灭和抑制致病微生物。土壤中复杂的微生物群和它抗生素所产生的高浓度的细菌使它有可能成为对多种抗生素的有耐药性决定因素。土壤细菌是最重要的耐药基因储存库。除了细菌本身的因素，抗菌药物的广泛使用使细菌产生耐药性。耐药基因能分解抗生素使之失效，延长治疗时间，增加治疗费用。基因的水平转移又是耐药性传播的重要环节，因此要在细菌之前获得耐药基因。本文主要探讨一个不受干扰的土壤环境中培养的细菌的四环素(Tet)抗性基因，我们对偏远的珠穆朗玛峰土壤进行了功能基因组的分析。同时进行细菌对抗生素最小抑菌浓度MIC的测定。
目录
摘要‥1
关键词1
Abstract 1
Keywords 1
引言2
一、材料与设备3
1 实验设备3
2 实验材料与试剂3
二、实验方法5
1.24孔板筛选 5
2.阳性克隆 5
2.1涂平板活性筛选 5
2.2阳性克隆摇菌 5
2.3 阳性克隆质粒的提取 5
2.3.1阳性克隆的保藏5
2.3.2质粒的提取 5
3.亚克隆的筛选 6
3.1 阳性克隆质粒部分酶切 6
3.2 质粒DNA片段电泳6
3.2.1制琼脂糖凝胶6
3.2.2加样6
3.2.3切胶回收6
3.3 载体制备7
3.3.1摇菌7
3.3.2载体提质粒7
3.3.3载体的酶切7
3.3.4载体去磷酸化8
3.4 连接转化涂平板 8
3.4.1连接8
3.4.2电转化8
3.4.3涂平板8
3.5 亚克隆切验证 9
3.5.1摇菌9
3.5.2亚克隆提质粒9
3.5.3亚克隆双酶切9
3.6 测序 9
4.细菌对抗生素最小抑菌浓度（MIC）的测定 9
4.1 抗生素稀释浓度的计算 9
/> 4.2 摇菌10 4.3测OD625值及菌液稀释10
4.3.1测OD625值 10
4.3.2菌液稀释 10
4.496孔板测定10
三、结果与分析 10
1. 24孔板筛选结果 10
2.阳性克隆结果11
3.阳性克隆质粒部分酶切DNA片段电泳结果 11
4.载体酶切DNA片段电泳结果 11
5.载体去磷酸化DNA片段电泳结果 12
6.亚克隆双酶切后DNA片段电泳结果 12
7.ZF1629 序列比对结果 13
四、讨论 15
致谢 16
参考文献 17
土壤宏基因组文库中四环素耐药基因的筛选
引言
引言
抗生素的出现被誉为新的“定点医疗发明时代”，医药学者不断研究新抗生素，用于人类各种疾病的治疗，但是过于依赖于抗生素和抗生素的滥用，引起了“超级细菌”的发生。近年来西方学者意识到抗生素滥用所造成的危害性，与此同时伴随着由抗生素滥用，细菌耐药性在不断增加[1]。这些携带抗性基因的菌株进入到环境中去，在同种内或在不同的物种之间交换基因，甚至能够从已经死亡的同类散落的DNA中获得基因, 从而造成了环境的抗性基因污染，抗生素抗性基因现在作为一类新型环境污染物，进行研究。近期关于人类，动物和环境中的基因和元基因组研究使人们发现一个叫做resistome的有抗生素耐药性的巨大的基因库，这些基因能够转移到人类病原体[2]。
耐药性研究常集在临床分离致病菌株，已经了解到细菌通过改变或保护抗生素作用靶位、降低抗生素进入细菌胞内、产生抗生素灭活酶和增强抗生素主动外排泵系统活性使药物排到胞外等机制来有效抑制抗生素[3,4,9] 。
本实验选用的四环素属于放线菌属产生的或半合成的一类广谱抗生素。四环素是应用最为广泛的一类抗菌药物在人类医学和兽医学。由于其广谱活性，成本低，口服给药，副作用少（Chopra和罗伯茨，2001，张等人，2010）。超过60年广泛的临床和非临床使用四环素类药物使得四环素耐药菌发生率增加。四环素抗性（TCR）发生主要通过三种机制：主动外排泵，核糖体保护，和酶失活。到目前为止，超过40种不同的抗性基因已被确定（Thaker et al.，2010），然而，临床中四环素耐药发生几乎完全通过核糖体保护或抗生素外排[5]。目前虽然有新的四环素类药物正在研究或处于临床试验阶段，但是对四环素耐药基因的研究缺乏。
除了在传染性病毒中由耐抗生素导致的威胁之外，人们对于耐药性基因的多样性，贡献和来源知道的少之又少，尤其是目前还不可培养的环境细菌。一个极有可能富有细菌且大部分都还没被研究的环境就是土壤。土壤中复杂的微生物群和它抗生素所产生的高浓度的细菌使它有可能成为对多种抗生素的有耐药性决定因素[7]。
宏基因组学这一概念最早是在1998年由威斯康辛大学植物病理学部门Handelsman等提出的：将整个土壤基因组看成是一个单元而不是先培养生物，就是共基因组方法，这整个土壤基因组就是宏基因组[8,11]。宏基因组学(metagenomics)以环境样品中的微生物群体基因组为研究对象,以功能基因筛选和测序分析为研究手段,以微生物多样性、种群结构、进化关系、功能活性、相互协作关系及与环境之间的关系为研究目的。宏基因组学技术的出现将对微生物的研究从单细胞水平转移到系统水平。
采用宏基因组技术及基因组测序等手段，来发现难培养或不可培养微生物中的天然产物以及处于“沉默”状态的天然产物，不仅克服了微生物难以培养的困难而且还可以结合生物信息学的方法，揭示微生物之间、微生物与环境之间相互作用的规律，大大拓展了微生物学的研究思路与方法，为从群落结构水平上全面认识微生物的生态特征和功能开辟了新的途径。目前,宏基因组学已经成为微生物研究的热点，广泛应用于人体肠道、水处理工程系统、气候变化、极端环境、生物冶金、石油污染修复等领域,取得了一系列重要的成果[10]。
本实验选用的文库菌源自偏远的珠穆朗玛峰土壤。珠穆朗玛峰（27°59′15.85″,东经86°55′39.51″）珠穆朗玛峰极大的海拔落差使其形成了从沟底亚热带生态系统逐步过渡到极寒带生态系统的垂直生态分布。我们期望可以中找到新型耐药基因。
目录
摘要‥1
关键词1
Abstract 1
Keywords 1
引言2
一、材料与设备3
1 实验设备3
2 实验材料与试剂3
二、实验方法5
1.24孔板筛选 5
2.阳性克隆 5
2.1涂平板活性筛选 5
2.2阳性克隆摇菌 5
2.3 阳性克隆质粒的提取 5
2.3.1阳性克隆的保藏5
2.3.2质粒的提取 5
3.亚克隆的筛选 6
3.1 阳性克隆质粒部分酶切 6
3.2 质粒DNA片段电泳6
3.2.1制琼脂糖凝胶6
3.2.2加样6
3.2.3切胶回收6
3.3 载体制备7
3.3.1摇菌7
3.3.2载体提质粒7
3.3.3载体的酶切7
3.3.4载体去磷酸化8
3.4 连接转化涂平板 8
3.4.1连接8
3.4.2电转化8
3.4.3涂平板8
3.5 亚克隆切验证 9
3.5.1摇菌9
3.5.2亚克隆提质粒9
3.5.3亚克隆双酶切9
3.6 测序 9
4.细菌对抗生素最小抑菌浓度（MIC）的测定 9
4.1 抗生素稀释浓度的计算 9
/> 4.2 摇菌10 4.3测OD625值及菌液稀释10
4.3.1测OD625值 10
4.3.2菌液稀释 10
4.496孔板测定10
三、结果与分析 10
1. 24孔板筛选结果 10
2.阳性克隆结果11
3.阳性克隆质粒部分酶切DNA片段电泳结果 11
4.载体酶切DNA片段电泳结果 11
5.载体去磷酸化DNA片段电泳结果 12
6.亚克隆双酶切后DNA片段电泳结果 12
7.ZF1629 序列比对结果 13
四、讨论 15
致谢 16
参考文献 17
土壤宏基因组文库中四环素耐药基因的筛选
引言
引言
抗生素的出现被誉为新的“定点医疗发明时代”，医药学者不断研究新抗生素，用于人类各种疾病的治疗，但是过于依赖于抗生素和抗生素的滥用，引起了“超级细菌”的发生。近年来西方学者意识到抗生素滥用所造成的危害性，与此同时伴随着由抗生素滥用，细菌耐药性在不断增加[1]。这些携带抗性基因的菌株进入到环境中去，在同种内或在不同的物种之间交换基因，甚至能够从已经死亡的同类散落的DNA中获得基因, 从而造成了环境的抗性基因污染，抗生素抗性基因现在作为一类新型环境污染物，进行研究。近期关于人类，动物和环境中的基因和元基因组研究使人们发现一个叫做resistome的有抗生素耐药性的巨大的基因库，这些基因能够转移到人类病原体[2]。
耐药性研究常集在临床分离致病菌株，已经了解到细菌通过改变或保护抗生素作用靶位、降低抗生素进入细菌胞内、产生抗生素灭活酶和增强抗生素主动外排泵系统活性使药物排到胞外等机制来有效抑制抗生素[3,4,9] 。
本实验选用的四环素属于放线菌属产生的或半合成的一类广谱抗生素。四环素是应用最为广泛的一类抗菌药物在人类医学和兽医学。由于其广谱活性，成本低，口服给药，副作用少（Chopra和罗伯茨，2001，张等人，2010）。超过60年广泛的临床和非临床使用四环素类药物使得四环素耐药菌发生率增加。四环素抗性（TCR）发生主要通过三种机制：主动外排泵，核糖体保护，和酶失活。到目前为止，超过40种不同的抗性基因已被确定（Thaker et al.，2010），然而，临床中四环素耐药发生几乎完全通过核糖体保护或抗生素外排[5]。目前虽然有新的四环素类药物正在研究或处于临床试验阶段，但是对四环素耐药基因的研究缺乏。
除了在传染性病毒中由耐抗生素导致的威胁之外，人们对于耐药性基因的多样性，贡献和来源知道的少之又少，尤其是目前还不可培养的环境细菌。一个极有可能富有细菌且大部分都还没被研究的环境就是土壤。土壤中复杂的微生物群和它抗生素所产生的高浓度的细菌使它有可能成为对多种抗生素的有耐药性决定因素[7]。
宏基因组学这一概念最早是在1998年由威斯康辛大学植物病理学部门Handelsman等提出的：将整个土壤基因组看成是一个单元而不是先培养生物，就是共基因组方法，这整个土壤基因组就是宏基因组[8,11]。宏基因组学(metagenomics)以环境样品中的微生物群体基因组为研究对象,以功能基因筛选和测序分析为研究手段,以微生物多样性、种群结构、进化关系、功能活性、相互协作关系及与环境之间的关系为研究目的。宏基因组学技术的出现将对微生物的研究从单细胞水平转移到系统水平。
采用宏基因组技术及基因组测序等手段，来发现难培养或不可培养微生物中的天然产物以及处于“沉默”状态的天然产物，不仅克服了微生物难以培养的困难而且还可以结合生物信息学的方法，揭示微生物之间、微生物与环境之间相互作用的规律，大大拓展了微生物学的研究思路与方法，为从群落结构水平上全面认识微生物的生态特征和功能开辟了新的途径。目前,宏基因组学已经成为微生物研究的热点，广泛应用于人体肠道、水处理工程系统、气候变化、极端环境、生物冶金、石油污染修复等领域,取得了一系列重要的成果[10]。
本实验选用的文库菌源自偏远的珠穆朗玛峰土壤。珠穆朗玛峰（27°59′15.85″,东经86°55′39.51″）珠穆朗玛峰极大的海拔落差使其形成了从沟底亚热带生态系统逐步过渡到极寒带生态系统的垂直生态分布。我们期望可以中找到新型耐药基因。
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