土壤微生物来源的新型四环素失活酶基因的异源表达
1四环素类抗生素的耐药机制主要有受核糖体保护、外排泵机制和失活酶作用机制，在此之中，四环素失活酶的耐药机制的研究相对较少。本实验的研究内容是土壤微生物来源的新型四环素失活酶基因的异源表达，实验中使用E. coli BL21作为宿主菌纯化后得到的杂蛋白较多，加入伴侣蛋白后的纯化效果也不理想，后期实验中使用了E. coli Rosseta宿主菌，将得到的四环素耐药阳性克隆的质粒导入E. coli Rosseta宿主菌，进行电转化后进行诱导表达，对得到的蛋白酶进行纯化，实验中采用SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶电泳检测纯化后的目的蛋白，得到纯化后的失活酶。
目录
引言
引言：四环素类抗生素发现于20世纪40年代，20世纪50年代被用于人类医学及畜牧业的生长促进剂，是最常见和最重要的抗生素之一[1]。四环素类抗生素在被首次报道后在临床各方面被大量使用 ，导致四环素类抗生素对细菌的抵抗水平逐渐降低[2]。随着细菌耐药性的广泛传播，严重影响了抗生素的作用，为临床治疗和公共卫生带来了巨大挑战。为控制细菌耐药性的产生和传播，我们不仅要关注临床上已出现的耐药基因，还应对耐药基因的起源及传播机制展开更深入的研究[3]。随着临床上四环素类抗生素耐药菌的大量产生及对其不良反应的深入了解，部分四环素类抗生素逐渐从临床应用退出，因此临床上急需抗菌谱更广、抗菌活性更强以及能克服耐药菌的新型四环素类抗生素[4]。环境微生物携带了数量庞大的新型耐药基因，挖掘新的耐药基因可以为临床上耐药性的防控提供有效的预警作用，同时也可为新抗生素的研发和改造提供参考 [5,6]。
临床中四环素类抗生素耐药性的出现主要是受核糖体保护、外排机制和酶失活导致的。核糖体保护蛋白类的机制是四环素与细菌的核糖体结合，从而干扰细菌蛋白质的翻译来发挥抗生素的作用。这种结果通常是抑制细菌的细胞生长，而不会使细菌细胞死亡；药物外排泵是存在于细菌细胞膜上的一类蛋白质。经过研究发现，许多细菌可以通过外排泵系统将进入胞内的抗菌药物泵出胞外，从而使菌体内药物浓度降低而起到耐药的效果；四环素失活酶的作用机理的研究相对较少，就是本次研究的基础。
1 材料与方法
1.1 材料与设备
1.1.1 材料试剂
500 mL的LB液体培养 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ￥351916072￥
基：胰蛋白胨 5 g ；酵母粉 2.5 g ；氯化钠5 g ；5 M氢氧化钠250 uL（固体LB培养基需加10 g琼脂）；121 ℃高压蒸汽灭菌备用。
IPTG诱导剂：IPTG 0.24 g加 1 mL ddH2O。
抗生素：四环素（Tet）； 卡那霉素（kana）（30 mg/mL）。
宿主菌：E. coli BL21 ；E. coli Rosseta
氯化镍
60%甘油
Washing Buffer（pH 8.0，2 L）：Tris 12.11 g 氯化钠 5.84 g
Lysis Buffer（pH8.0，500 mL）：Tris 3.03 g，氯化钠 2.92 g ，Triton（1%）5mL
Imidazole（pH8.0 ，500 mL）：Tris 3.03 g 氯化钠 1.461 g Imidazole 17.03 g
脱色液：95%乙醇：冰醋酸：水 = 45：5：50（体积比）
保存液：7%冰醋酸
染色液：考马斯亮蓝R250 0.25 g， 95%乙醇84 mL，冰醋酸20 mL，定容至200mL。
灭菌平板，1.5 mL，2mL EP管若干。
质粒小提盒1个。
1.1.2 实验仪器
立式压力蒸汽灭菌器，上海博讯实业有限公司医疗设备厂；
SWCJIBU超净工作台，苏州苏洁净化设备有限公司；
Centrifuge 5804R冷冻离心机，德国Eppendorf公司；
PTC100TM PCR仪，MJ Research公司；
PowPac TM HC1645052高电流电泳仪，BioRad生命医学产品有限公司；
JS380C 全自动数码凝胶成像分析仪，上海培清科技有限公司；
Orion 3 STAR pH计，美国Thermo公司；
组合式全温度震荡培养箱，太仓市华美生化仪器厂。
1.2 实验方法
1.2.1 失活酶的诱导表达
1.2.1.1 E. coli BL 21感受态细胞的制备
制备过程为：（1）将保存在80 °C冰箱的E. coli BL21宿主在LB固体培养基上进行平板划线，经过37 °C培养18h20 h后挑取平板上的单菌落接种到10 mL 液体LB培养基中，37 °C、225 rpm摇床培养过夜[8];
（2）将培养过夜后的菌液按照1%的量转接到1个400 mL YENB培养基中，扩大培养，37 °C、200 rpm摇床培养条件下培养直至OD600值达到0.40.6，此时的菌体生长状态比较好[9]；
（3）将菌液倒入2个预冷的250 mL 的灭菌的离心瓶中，放入冰水中预冷[8]；
（4）将预冷的菌液放入预冷至4 °C离心机中，4000 rpm离心10 min，收集菌体，弃掉上清[8]；
（5）用100 mL预冷的灭菌二次水重悬菌体，4000 rpm离心10 min，收集菌体，弃掉上清；
（6）重复步骤（5）；
（7）用100 mL预冷的灭菌20%甘油重悬菌体，4000 rpm离心10 min，收集菌体，弃掉上清；
（8）重复步骤（7）；
（9）用12 mL预冷的灭菌20%甘油重悬菌体，取50 μL菌液分装到预冷的1.5 mL EP管中，保存在80 °C冰箱保存备用[9]。
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引言
引言：四环素类抗生素发现于20世纪40年代，20世纪50年代被用于人类医学及畜牧业的生长促进剂，是最常见和最重要的抗生素之一[1]。四环素类抗生素在被首次报道后在临床各方面被大量使用 ，导致四环素类抗生素对细菌的抵抗水平逐渐降低[2]。随着细菌耐药性的广泛传播，严重影响了抗生素的作用，为临床治疗和公共卫生带来了巨大挑战。为控制细菌耐药性的产生和传播，我们不仅要关注临床上已出现的耐药基因，还应对耐药基因的起源及传播机制展开更深入的研究[3]。随着临床上四环素类抗生素耐药菌的大量产生及对其不良反应的深入了解，部分四环素类抗生素逐渐从临床应用退出，因此临床上急需抗菌谱更广、抗菌活性更强以及能克服耐药菌的新型四环素类抗生素[4]。环境微生物携带了数量庞大的新型耐药基因，挖掘新的耐药基因可以为临床上耐药性的防控提供有效的预警作用，同时也可为新抗生素的研发和改造提供参考 [5,6]。
临床中四环素类抗生素耐药性的出现主要是受核糖体保护、外排机制和酶失活导致的。核糖体保护蛋白类的机制是四环素与细菌的核糖体结合，从而干扰细菌蛋白质的翻译来发挥抗生素的作用。这种结果通常是抑制细菌的细胞生长，而不会使细菌细胞死亡；药物外排泵是存在于细菌细胞膜上的一类蛋白质。经过研究发现，许多细菌可以通过外排泵系统将进入胞内的抗菌药物泵出胞外，从而使菌体内药物浓度降低而起到耐药的效果；四环素失活酶的作用机理的研究相对较少，就是本次研究的基础。
1 材料与方法
1.1 材料与设备
1.1.1 材料试剂
500 mL的LB液体培养 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ￥351916072￥
基：胰蛋白胨 5 g ；酵母粉 2.5 g ；氯化钠5 g ；5 M氢氧化钠250 uL（固体LB培养基需加10 g琼脂）；121 ℃高压蒸汽灭菌备用。
IPTG诱导剂：IPTG 0.24 g加 1 mL ddH2O。
抗生素：四环素（Tet）； 卡那霉素（kana）（30 mg/mL）。
宿主菌：E. coli BL21 ；E. coli Rosseta
氯化镍
60%甘油
Washing Buffer（pH 8.0，2 L）：Tris 12.11 g 氯化钠 5.84 g
Lysis Buffer（pH8.0，500 mL）：Tris 3.03 g，氯化钠 2.92 g ，Triton（1%）5mL
Imidazole（pH8.0 ，500 mL）：Tris 3.03 g 氯化钠 1.461 g Imidazole 17.03 g
脱色液：95%乙醇：冰醋酸：水 = 45：5：50（体积比）
保存液：7%冰醋酸
染色液：考马斯亮蓝R250 0.25 g， 95%乙醇84 mL，冰醋酸20 mL，定容至200mL。
灭菌平板，1.5 mL，2mL EP管若干。
质粒小提盒1个。
1.1.2 实验仪器
立式压力蒸汽灭菌器，上海博讯实业有限公司医疗设备厂；
SWCJIBU超净工作台，苏州苏洁净化设备有限公司；
Centrifuge 5804R冷冻离心机，德国Eppendorf公司；
PTC100TM PCR仪，MJ Research公司；
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JS380C 全自动数码凝胶成像分析仪，上海培清科技有限公司；
Orion 3 STAR pH计，美国Thermo公司；
组合式全温度震荡培养箱，太仓市华美生化仪器厂。
1.2 实验方法
1.2.1 失活酶的诱导表达
1.2.1.1 E. coli BL 21感受态细胞的制备
制备过程为：（1）将保存在80 °C冰箱的E. coli BL21宿主在LB固体培养基上进行平板划线，经过37 °C培养18h20 h后挑取平板上的单菌落接种到10 mL 液体LB培养基中，37 °C、225 rpm摇床培养过夜[8];
（2）将培养过夜后的菌液按照1%的量转接到1个400 mL YENB培养基中，扩大培养，37 °C、200 rpm摇床培养条件下培养直至OD600值达到0.40.6，此时的菌体生长状态比较好[9]；
（3）将菌液倒入2个预冷的250 mL 的灭菌的离心瓶中，放入冰水中预冷[8]；
（4）将预冷的菌液放入预冷至4 °C离心机中，4000 rpm离心10 min，收集菌体，弃掉上清[8]；
（5）用100 mL预冷的灭菌二次水重悬菌体，4000 rpm离心10 min，收集菌体，弃掉上清；
（6）重复步骤（5）；
（7）用100 mL预冷的灭菌20%甘油重悬菌体，4000 rpm离心10 min，收集菌体，弃掉上清；
（8）重复步骤（7）；
（9）用12 mL预冷的灭菌20%甘油重悬菌体，取50 μL菌液分装到预冷的1.5 mL EP管中，保存在80 °C冰箱保存备用[9]。
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