宣威火腿中多肽抗氧化活性的研究
摘要：在长期发酵过程中，宣威火腿中的蛋白质可酶解成不同分子量大小的多肽片段。本实验采用磷酸溶解法提取宣威火腿中的多肽，并测定其冻干粉的多肽含量及提取率。以谷胱甘肽为对照，在不同浓度条件下，体外测定宣威火腿粗多肽的1,1-二苯基-2三硝基苯肼（DPPH）自由基清除率、螯合金属离子能力、清除超氧阴离子自由基（O2-·）清除率和还原力。通过体外测定自由基清除率及还原力，研究宣威火腿多肽的体外抗氧化活性，从而为进一步研究宣威火腿多肽的吸收机制及体内抗氧化效果提供理论基础。
目录
摘要 3
关键词 3
Abstract 3
Key words 3
1. 材料与方法 4
1.1 材料 4
1.1.1 实验材料 4
1.1.2 试剂 4
1.1.3 设备 4
1.2 试验方法 4
1.2.1 宣威火腿粗多肽的提取 4
1.2.2 粗肽粉中多肽含量的测定 4
1.2.3 粗多肽抗氧化活性的测定 5
2. 结果与分析 6
2.1 宣威火腿粗肽粉的提取 6
2.2 宣威火腿粗肽液对DPPH自由基的清除效果 6
2.3 宣威火腿粗肽液对亚铁离子（Fe2+）螯合能力 7
2.4 宣威火腿对超氧阴离子自由基清除效果 8
2.5 宣威火腿粗肽液的还原力的测定 8
3. 讨论 9
致谢 9
参考文献 10
宣威火腿中多肽抗氧化活性的研究
引言
人体在正常的生理代谢过程中产生的含氧自由基是维持生命所必需的，体内的自由基总处于不断产生与消除的动态平衡中。随着年龄的增大或疾病的干扰，生物体内抗氧化酶活性会逐渐降低，导致机体内过多的自由基不能被及时清除而堆积在细胞内，就会破坏细胞膜、蛋白质、引起线粒体DNA的氧化、损伤、导致氧化应激等，进而引发不同程度的疾病[1]。多肽是构成蛋白质的片段，蛋白质的生理功能由氨基酸及多肽的结构决定，多肽本身也有着多种多样的生理功能[2]。有研究表明抗氧化多肽有清除体内自由基的作用[3]。近年来天然抗氧化剂因其高效、低
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毒、易吸收的特点越来越受到人们的重视[4]。但天然抗氧化剂也受到诸如价格高、活性难保持、颜色差异度高等因素的制约。因此，选择适宜的原料、提高分离纯化的效率以降低成本、提高其活性形式的稳定性已成为天然抗氧化剂研究重点。目前，人们已经从多种来源分离纯化了不同的抗氧化肽，如玉米源抗氧化活性肽[5]、大豆源抗氧化活性肽[6]、海蜇抗氧化活性肽[7]等。动物蛋白原抗氧化肽在生物体内已表现出了抗氧化性[8]，李永华[9]等已证实马氏珍珠贝肉提取液能促进小鼠提高记忆能力和学习速度，可以起到一定的抗衰老作用。
宣威火腿历史悠久，驰名中外，是中国三大名腿之一，也是国优名特产品。因此，宣威成了著名的云腿之乡，宣威火腿至今已有几百年的历史，早在清雍正五年就远涉重洋，销往海外，并在国际上享有盛誉。宣威火腿形似琵琶，身穿绿袍，三针青香无异味，且富含蛋白质、脂肪、氨基酸、微量元素和维生素等多种营养物质。其风味的形成，除以猪种、饲养、加工技术有关外，发酵过程是最重要的影响环节，经云南省微生物研究的研究表明，国内外种类的火腿，其主系列成份大同小异，但非主系列成份（营养成份及色香味）因发酵方法的不同而不同。目前已有较多对其工艺特色、香味活性化合物的分析、微生物菌相构成、发酵过程中蛋白质降解等方面的研究[1013]，对其中多肽的抗氧化活性的研究鲜见报道。本实验从宣威火腿粗多肽的提取着手，测定粗肽提取物清除自由基，螯合金属离子能力及总还原能力，研究其抗氧化活性，为解释干腌火腿的功能特性提供理论依据。
1.材料与方法
1.1材料
1.1.1实验材料
宣威火腿（云南省宣威市浦记火腿食品有限公司）
1.1.2试剂
磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、无水乙醇、邻苯二甲醛、四硼酸钠、SDS、β巯基乙醇、胰酪蛋白胨、1, 1二苯基苦基苯肼(DPPH)、还原型辅酶Ⅰ(NADH)、氯化硝基四氮唑蓝(NBT)、吩嗪硫酸甲酯(PMS)、氯化亚铁、菲咯嗪、铁氰化钾、醋酸、氯化铁
1.1.3设备
T25匀浆机，德国IKA公司；
RE52AA旋转蒸发器，上海亚荣生化仪器厂；
冷冻干燥机，德国Christ公司；
Spectral Max M2e多功能酶标仪，美国伯腾仪器有限公司；
UV2450，日本岛津公司；
水浴锅，德国优莱博公司。
1.2试验方法
1.2.1宣威火腿粗多肽的提取
对Zhu等[14]的方法进行适当改进来提取宣威火腿的粗多肽。
将成熟的火腿肉去除肥肉及瘦肉中肌腱、肌膜，切碎斩匀。取30 g经上述处理的宣威火腿， 取90ml pH 7.2，0.2 mol?L1 磷酸盐缓冲液作为提取剂，20000 rmin1 ，匀浆3次，每次10 s 。将匀浆液放入4 ℃冷库，静置20 min后，4 ℃离心（12000 g，20 min）；上清液滤纸过滤，滤液加入3倍体积的40%的乙醇溶液(V:V)，4 ℃，静置过夜后，4 ℃离心（12000 g，10 min）。上清液旋蒸浓缩，浓缩液经冷冻干燥后即为粗肽粉，保存在﹣20 ℃冰箱中。
1.2.2粗肽粉中多肽含量的测定
用邻苯二甲醛来测定粗肽粉中多肽的含量[15]。
邻苯二甲醛混合试剂的配制方法：40 mg邻苯二甲醛溶解于1 mL甲醇中，再加入25 mL0.1 mol?L1四硼酸钠溶液 、2.5 mL 20%SDS（w/w）和100 μL β巯基乙醇，用去离子水将溶液定容至50 mL。
胰酪蛋白胨标准曲线的制作：取10支试管，分别加入1 mg/mL牛血清蛋白标准溶液0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0 mL，各管以去离子水补齐至1.0 mL。各管分别取100 μL与2.0 mL邻苯二甲醛混合试剂混合反应，室温下孵育2 min后紫外分光光度计测定340 nm波长处的吸光值。以试管中胰酪蛋白胨浓度为横坐标，吸光值为纵坐标，绘制胰酪蛋白胨标准曲线。
配置质量浓度为1 mg?mL1 的粗肽液。取100 μL粗肽液与2.0 mL邻苯二甲醛混合试剂，混匀。室温下孵育2 min后紫外分光光度计测定340 nm波长处的吸光值，根据标准曲线计算出宣威火腿粗肽粉中的多肽含量，并计算多肽提取率。
1.2.3粗多肽抗氧化活性的测定
1.2.3.1 DPPH自由基清除活性测定
对Sheih等[16]的方法进行适当改进来测定DPPH自由基清除活性。
将宣威火腿粗肽配制成质量浓度为1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mg?mL1五个不同浓度梯度 的溶液。取不同浓度的样品溶液1.0 ml于试管中，分别加入1 ml DPPH溶液（0.2 mmol?L1, 95 %乙醇溶解），混匀反应体系，避光保存30 min后于分光光度计517 nm处测吸光值。
清除效果依下面公式计算：
DPPH自由基清除率% = [1（A样品 A0）/(A对照 A0)] ×100
目录
摘要 3
关键词 3
Abstract 3
Key words 3
1. 材料与方法 4
1.1 材料 4
1.1.1 实验材料 4
1.1.2 试剂 4
1.1.3 设备 4
1.2 试验方法 4
1.2.1 宣威火腿粗多肽的提取 4
1.2.2 粗肽粉中多肽含量的测定 4
1.2.3 粗多肽抗氧化活性的测定 5
2. 结果与分析 6
2.1 宣威火腿粗肽粉的提取 6
2.2 宣威火腿粗肽液对DPPH自由基的清除效果 6
2.3 宣威火腿粗肽液对亚铁离子（Fe2+）螯合能力 7
2.4 宣威火腿对超氧阴离子自由基清除效果 8
2.5 宣威火腿粗肽液的还原力的测定 8
3. 讨论 9
致谢 9
参考文献 10
宣威火腿中多肽抗氧化活性的研究
引言
人体在正常的生理代谢过程中产生的含氧自由基是维持生命所必需的，体内的自由基总处于不断产生与消除的动态平衡中。随着年龄的增大或疾病的干扰，生物体内抗氧化酶活性会逐渐降低，导致机体内过多的自由基不能被及时清除而堆积在细胞内，就会破坏细胞膜、蛋白质、引起线粒体DNA的氧化、损伤、导致氧化应激等，进而引发不同程度的疾病[1]。多肽是构成蛋白质的片段，蛋白质的生理功能由氨基酸及多肽的结构决定，多肽本身也有着多种多样的生理功能[2]。有研究表明抗氧化多肽有清除体内自由基的作用[3]。近年来天然抗氧化剂因其高效、低
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毒、易吸收的特点越来越受到人们的重视[4]。但天然抗氧化剂也受到诸如价格高、活性难保持、颜色差异度高等因素的制约。因此，选择适宜的原料、提高分离纯化的效率以降低成本、提高其活性形式的稳定性已成为天然抗氧化剂研究重点。目前，人们已经从多种来源分离纯化了不同的抗氧化肽，如玉米源抗氧化活性肽[5]、大豆源抗氧化活性肽[6]、海蜇抗氧化活性肽[7]等。动物蛋白原抗氧化肽在生物体内已表现出了抗氧化性[8]，李永华[9]等已证实马氏珍珠贝肉提取液能促进小鼠提高记忆能力和学习速度，可以起到一定的抗衰老作用。
宣威火腿历史悠久，驰名中外，是中国三大名腿之一，也是国优名特产品。因此，宣威成了著名的云腿之乡，宣威火腿至今已有几百年的历史，早在清雍正五年就远涉重洋，销往海外，并在国际上享有盛誉。宣威火腿形似琵琶，身穿绿袍，三针青香无异味，且富含蛋白质、脂肪、氨基酸、微量元素和维生素等多种营养物质。其风味的形成，除以猪种、饲养、加工技术有关外，发酵过程是最重要的影响环节，经云南省微生物研究的研究表明，国内外种类的火腿，其主系列成份大同小异，但非主系列成份（营养成份及色香味）因发酵方法的不同而不同。目前已有较多对其工艺特色、香味活性化合物的分析、微生物菌相构成、发酵过程中蛋白质降解等方面的研究[1013]，对其中多肽的抗氧化活性的研究鲜见报道。本实验从宣威火腿粗多肽的提取着手，测定粗肽提取物清除自由基，螯合金属离子能力及总还原能力，研究其抗氧化活性，为解释干腌火腿的功能特性提供理论依据。
1.材料与方法
1.1材料
1.1.1实验材料
宣威火腿（云南省宣威市浦记火腿食品有限公司）
1.1.2试剂
磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、无水乙醇、邻苯二甲醛、四硼酸钠、SDS、β巯基乙醇、胰酪蛋白胨、1, 1二苯基苦基苯肼(DPPH)、还原型辅酶Ⅰ(NADH)、氯化硝基四氮唑蓝(NBT)、吩嗪硫酸甲酯(PMS)、氯化亚铁、菲咯嗪、铁氰化钾、醋酸、氯化铁
1.1.3设备
T25匀浆机，德国IKA公司；
RE52AA旋转蒸发器，上海亚荣生化仪器厂；
冷冻干燥机，德国Christ公司；
Spectral Max M2e多功能酶标仪，美国伯腾仪器有限公司；
UV2450，日本岛津公司；
水浴锅，德国优莱博公司。
1.2试验方法
1.2.1宣威火腿粗多肽的提取
对Zhu等[14]的方法进行适当改进来提取宣威火腿的粗多肽。
将成熟的火腿肉去除肥肉及瘦肉中肌腱、肌膜，切碎斩匀。取30 g经上述处理的宣威火腿， 取90ml pH 7.2，0.2 mol?L1 磷酸盐缓冲液作为提取剂，20000 rmin1 ，匀浆3次，每次10 s 。将匀浆液放入4 ℃冷库，静置20 min后，4 ℃离心（12000 g，20 min）；上清液滤纸过滤，滤液加入3倍体积的40%的乙醇溶液(V:V)，4 ℃，静置过夜后，4 ℃离心（12000 g，10 min）。上清液旋蒸浓缩，浓缩液经冷冻干燥后即为粗肽粉，保存在﹣20 ℃冰箱中。
1.2.2粗肽粉中多肽含量的测定
用邻苯二甲醛来测定粗肽粉中多肽的含量[15]。
邻苯二甲醛混合试剂的配制方法：40 mg邻苯二甲醛溶解于1 mL甲醇中，再加入25 mL0.1 mol?L1四硼酸钠溶液 、2.5 mL 20%SDS（w/w）和100 μL β巯基乙醇，用去离子水将溶液定容至50 mL。
胰酪蛋白胨标准曲线的制作：取10支试管，分别加入1 mg/mL牛血清蛋白标准溶液0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0 mL，各管以去离子水补齐至1.0 mL。各管分别取100 μL与2.0 mL邻苯二甲醛混合试剂混合反应，室温下孵育2 min后紫外分光光度计测定340 nm波长处的吸光值。以试管中胰酪蛋白胨浓度为横坐标，吸光值为纵坐标，绘制胰酪蛋白胨标准曲线。
配置质量浓度为1 mg?mL1 的粗肽液。取100 μL粗肽液与2.0 mL邻苯二甲醛混合试剂，混匀。室温下孵育2 min后紫外分光光度计测定340 nm波长处的吸光值，根据标准曲线计算出宣威火腿粗肽粉中的多肽含量，并计算多肽提取率。
1.2.3粗多肽抗氧化活性的测定
1.2.3.1 DPPH自由基清除活性测定
对Sheih等[16]的方法进行适当改进来测定DPPH自由基清除活性。
将宣威火腿粗肽配制成质量浓度为1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mg?mL1五个不同浓度梯度 的溶液。取不同浓度的样品溶液1.0 ml于试管中，分别加入1 ml DPPH溶液（0.2 mmol?L1, 95 %乙醇溶解），混匀反应体系，避光保存30 min后于分光光度计517 nm处测吸光值。
清除效果依下面公式计算：
DPPH自由基清除率% = [1（A样品 A0）/(A对照 A0)] ×100
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