宏基因组文库中耐药阳性克隆的筛选
摘要：构建土壤环境微生物宏基因组文库，筛选土壤微生物中的新型耐药基因，测序后与已知耐药基因进行比对和分析并用MIC法测得最小抑菌浓度。用四环素在24孔板上初步筛选出宏基因组文库中疑似耐药阳性菌，将其涂布与含有氨苄青霉素、氯霉素和四环素的平板上进一步筛选，过夜培养后，在平板上挑取单菌落在含有三抗的LB培养基中培养。对筛选到的疑似阳性克隆菌提取质粒并进行部分酶切，回收3-5K的DNA片段与载体连接，脱盐后电转化导入感受态大肠杆菌中构建亚克隆，涂布于含有氨苄青霉素和四环素的LB平板上，过夜培养后，对平板上符合大肠杆菌形态的单菌落进行亚克隆测序和序列分析。筛选出的耐药阳性克隆经测序后发现，该DNA可以编码一种破坏酶，使四环素失去活性。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言2
1实验材料与方法2
1.1实验材料 2
1.1.1样品来源2
1.1.2菌种与质粒2
1.1.3主要试剂2
1.2 24孔板初筛3
1.3阳性克隆抗性验证3
1.4载体制备4
1.5建立亚克隆4
1.6双酶切验证片段大小5
1.7DNA测序5
1.8 MIC法测最小抑菌浓度 5
2 实验结果与分析5
2.1耐药阳性克隆 5
2.2载体的制备6
2.3亚克隆的构建7
2.4插入片段序列分析7
2.5 BLAST比对结果及分析 8
讨论9
致谢9
参考文献10
附录10
宏基因组文库中耐药阳性的筛选
引言
引言 抗生素是指由微生物在代谢过程中产生的，在低浓度下就能抑制它种微生物代谢和活动，甚至杀死它种微生物的化学物质。自从上个世纪40年代被应用于临床以来，抗生素已经被越来越广泛地应用于疾病的治疗和防治当中，为人类对抗疾病、延长寿命作出了不俗的贡献。同时，抗生素也被应用于畜牧业和养殖业中，以抑制动物体内细菌的繁殖和促进动物生长的速度，既保障了动物
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的健康，又促进了产业的经济效益。
与此同时，对于抗生素细菌开始产生耐药性。这本是客观存在的生物学现象。然而，近年来随着抗菌药物的不断发展和应用，病原菌对抗生素的耐药性不断增加，这严重威胁着人类身体健康，细菌耐药问题也日益受到人们的重视[12]。细菌耐药性机制主要有五种，一是产生灭活酶，使抗生素失活或结构改变；二是改变抗菌药物的靶位置，使之不与细菌结合；三是产生代谢拮抗剂与药物争夺靶酶；四是通过主动外排作用将药物排出体外；五是细菌自身分泌细胞外多糖蛋白复合物将细菌包绕形成细菌生物被膜。
2006年 Pruden 等首次提出抗生素抗性基因（Antibiotics resistance genes, ARGs) 的存在会对环境造成污染的观点。而进一步的研究表明，环境中抗生素抗性基因的危害性并不只是污染环境那么简单——抗生素抗性基因在环境中的持久性残留, 以及在不同环境介质中的传播、扩散往往可能比抗生素本身对环境的危害更大。作为一种新型的污染物[3]，人们不仅应当关注抗生素在环境中的残留、归趋以及对环境的影响, 更应该将抗生素抗性基因的起源、传播和影响因素以及其对环境、人体健康的影响作为关注的焦点[4]。
抗生素耐药性的获得方式有两种，一种是由产抗生素的微生物为了保护自身不受损伤和在竞争激烈的微生物圈中存活而自发产生[5]；另一种是基因转移，通过细胞与细胞之间的接合，裸露DNA(质粒或线性DNA)的转化作用，噬菌体介导的转导作用获得耐药性基因[6] , 从而获得耐药性。
ARGs产生后传播速度非常快，其传播方式主要分为水平转移和垂直转移。一般认为水平基因转移是环境中抗性基因传递的最重要途径，通过水平基因转移，ARGs可以在土壤、水体、空气以及动植物体内等环境中转移扩散[7]。
在我国医用抗生素的滥用现象严重，住院患者对抗生素药物使用率高达80％，通过多种抗生素联合治疗的占58％，远高于西方国家的30％[8,9]。每年有4万死亡病例是由耐药菌所致，与世界其它国家相比，我国已成为世界上滥用抗生素最为严重的国家之一[10]。
随着新型抗生素的开发、抗生素类药物在临床中的广泛应用，以及在农业中的普及，尤以在饲料、兽药、水产养殖方面的过度使用为代表，抗生素抗性基因在全球范围内广泛传播并且途径多样。由于目前市场上并没有良好的抗生素替代药物的产生，所以研究抗生素抗性基因（ARGs)的来源、在环境中扩散的机制从而有效阻止这类基因的进一步扩散，和筛选相关抗性基因研制新型替代类药物势在必行。
1 材料与方法
1.1 实验材料
1.1.1样品来源
实验室已经成功构建珠峰土壤文库。用珠峰土壤为样品，以直接提取土壤DNA的方法构建，包含有高质量的环境微生物总DNA。文库含2176个编号，每个编号含5000左右克隆，每个克隆 40kb，文库总量为400Gb。
1.1.2菌种与质粒
本课题所用的菌种为E.coli ,主要用于宏基因组文库的宿主。
感受态大肠杆菌为EPI100。
载体为PTG19T。
1.1.3 主要试剂
1.1.3.1 酶制剂与抗生素
本实验所用酶试剂及抗生素见表1.1
表1.1 本实验所用酶制剂和抗生素
Table1.1 Enzymes and antibiotics used in this study
试剂
英文名称
供应商
氨苄青霉素
Ampicillin
上海捷瑞生物有限公司
氯霉素
Chloramphenicol?
上海捷瑞生物有限公司
四环素
Tetracycline
上海捷瑞生物有限公司
酶切
BamHI,Sau3AI
Takara
ECORI,HindⅢ
Thermo
酶连
10xT4 ligase bufferT4 ligase
Thermo
DNA Marker
Generay
1.1.4 培养基
本实验所用培养基配方及配置方法如下：
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言2
1实验材料与方法2
1.1实验材料 2
1.1.1样品来源2
1.1.2菌种与质粒2
1.1.3主要试剂2
1.2 24孔板初筛3
1.3阳性克隆抗性验证3
1.4载体制备4
1.5建立亚克隆4
1.6双酶切验证片段大小5
1.7DNA测序5
1.8 MIC法测最小抑菌浓度 5
2 实验结果与分析5
2.1耐药阳性克隆 5
2.2载体的制备6
2.3亚克隆的构建7
2.4插入片段序列分析7
2.5 BLAST比对结果及分析 8
讨论9
致谢9
参考文献10
附录10
宏基因组文库中耐药阳性的筛选
引言
引言 抗生素是指由微生物在代谢过程中产生的，在低浓度下就能抑制它种微生物代谢和活动，甚至杀死它种微生物的化学物质。自从上个世纪40年代被应用于临床以来，抗生素已经被越来越广泛地应用于疾病的治疗和防治当中，为人类对抗疾病、延长寿命作出了不俗的贡献。同时，抗生素也被应用于畜牧业和养殖业中，以抑制动物体内细菌的繁殖和促进动物生长的速度，既保障了动物
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的健康，又促进了产业的经济效益。
与此同时，对于抗生素细菌开始产生耐药性。这本是客观存在的生物学现象。然而，近年来随着抗菌药物的不断发展和应用，病原菌对抗生素的耐药性不断增加，这严重威胁着人类身体健康，细菌耐药问题也日益受到人们的重视[12]。细菌耐药性机制主要有五种，一是产生灭活酶，使抗生素失活或结构改变；二是改变抗菌药物的靶位置，使之不与细菌结合；三是产生代谢拮抗剂与药物争夺靶酶；四是通过主动外排作用将药物排出体外；五是细菌自身分泌细胞外多糖蛋白复合物将细菌包绕形成细菌生物被膜。
2006年 Pruden 等首次提出抗生素抗性基因（Antibiotics resistance genes, ARGs) 的存在会对环境造成污染的观点。而进一步的研究表明，环境中抗生素抗性基因的危害性并不只是污染环境那么简单——抗生素抗性基因在环境中的持久性残留, 以及在不同环境介质中的传播、扩散往往可能比抗生素本身对环境的危害更大。作为一种新型的污染物[3]，人们不仅应当关注抗生素在环境中的残留、归趋以及对环境的影响, 更应该将抗生素抗性基因的起源、传播和影响因素以及其对环境、人体健康的影响作为关注的焦点[4]。
抗生素耐药性的获得方式有两种，一种是由产抗生素的微生物为了保护自身不受损伤和在竞争激烈的微生物圈中存活而自发产生[5]；另一种是基因转移，通过细胞与细胞之间的接合，裸露DNA(质粒或线性DNA)的转化作用，噬菌体介导的转导作用获得耐药性基因[6] , 从而获得耐药性。
ARGs产生后传播速度非常快，其传播方式主要分为水平转移和垂直转移。一般认为水平基因转移是环境中抗性基因传递的最重要途径，通过水平基因转移，ARGs可以在土壤、水体、空气以及动植物体内等环境中转移扩散[7]。
在我国医用抗生素的滥用现象严重，住院患者对抗生素药物使用率高达80％，通过多种抗生素联合治疗的占58％，远高于西方国家的30％[8,9]。每年有4万死亡病例是由耐药菌所致，与世界其它国家相比，我国已成为世界上滥用抗生素最为严重的国家之一[10]。
随着新型抗生素的开发、抗生素类药物在临床中的广泛应用，以及在农业中的普及，尤以在饲料、兽药、水产养殖方面的过度使用为代表，抗生素抗性基因在全球范围内广泛传播并且途径多样。由于目前市场上并没有良好的抗生素替代药物的产生，所以研究抗生素抗性基因（ARGs)的来源、在环境中扩散的机制从而有效阻止这类基因的进一步扩散，和筛选相关抗性基因研制新型替代类药物势在必行。
1 材料与方法
1.1 实验材料
1.1.1样品来源
实验室已经成功构建珠峰土壤文库。用珠峰土壤为样品，以直接提取土壤DNA的方法构建，包含有高质量的环境微生物总DNA。文库含2176个编号，每个编号含5000左右克隆，每个克隆 40kb，文库总量为400Gb。
1.1.2菌种与质粒
本课题所用的菌种为E.coli ,主要用于宏基因组文库的宿主。
感受态大肠杆菌为EPI100。
载体为PTG19T。
1.1.3 主要试剂
1.1.3.1 酶制剂与抗生素
本实验所用酶试剂及抗生素见表1.1
表1.1 本实验所用酶制剂和抗生素
Table1.1 Enzymes and antibiotics used in this study
试剂
英文名称
供应商
氨苄青霉素
Ampicillin
上海捷瑞生物有限公司
氯霉素
Chloramphenicol?
上海捷瑞生物有限公司
四环素
Tetracycline
上海捷瑞生物有限公司
酶切
BamHI,Sau3AI
Takara
ECORI,HindⅢ
Thermo
酶连
10xT4 ligase bufferT4 ligase
Thermo
DNA Marker
Generay
1.1.4 培养基
本实验所用培养基配方及配置方法如下：
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