宏基因组文库中新型酯酶功能的筛选及鉴定分析
摘要：在本研究中，本实验室采集来源于我国云南栗树林地区的土壤样品，并成功构建了一个高质量的宏基因组科斯质粒文库。通过利用该文库进行功能筛选，我们发现了新型酯酶EstGX3。多序列比对和进化树分析表明：预测蛋白酶是微生物脂类水解酶第Ⅳ家族的新成员。聚丙烯酰胺蛋白胶分析表明纯化后的EstGX3几乎显示为一条带，它的分子量大小与预测的分子量40kDa相一致。随后，本实验对纯化酯酶EstGX3的生化特性进行分析，处理的相关酶学特性包括最适pH、最适温度以及该酶对有机溶剂和金属离子的耐受性等。
目录
摘 要1
ABSTRACT1
引言 1
第一章 羧酸酯酶的裂解和纯化 2
1 实验材料 2
1.1 菌株与载体 2
1.2 酶及生化试剂 2
1.3 常用溶液配制 2
1.4 实验仪器 3
2 实验方法 3
2.1 重组酯酶的裂解及亲和层析纯化 3
2.2重组酯酶进一步纯化和酶活验证 4
2.3重组酯酶的SDSPAGE 凝胶检测 4
3 实验结果分析 4
4 讨论 5
第二章 重组羧酸酯酶EstGX3酶学性质表征 6
1 实验材料 6
1.1 酶及化学试剂 6
1.2 常用溶液配制 6
1.3 实验仪器 6
2 实验方法 7
2.1 酯酶EstGX3的活力测定 7
2.2 酶促反应时间研究 7
2.3 不同温度对EstGX3活性的影响 7
2.4 不同pH对EstGX3活性的影响 7
2.5不同浓度的EDTA以及不同类型的金属离子对EstGX3酶活影响的测定 7
2.6 有机溶剂EstGX3酶活的影响 8
3 实验结果分析 8
3.1 EstGX3的最适温度测定 8
3.2 EstGX3的最适pH测定 8
3.3 不同浓度EDTA以及不同类型金属离子金属离子对EstGX3酶活影响的测定 9
3.4 不同有机溶剂对EstGX3酶活
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: *351916072*
影响的测定 10
4 讨论 10
致谢 11
参考文献 11
宏基因组文库中新型酯酶功能的筛选及其鉴定分析
引言
引言
土壤微生物已经成为发现新的酶和多元活性次生代谢产物[1,2]的一个重要来源。然而,从正常基于培养微生物的方法得到新基因产物的难度持续上升,因为大多数微生物((99%)在目前实验室条件[3]不可培养。广阔的不可培养的微生物代表一个待探索的大基因库[4]。
宏基因组学时代的到来，意味着此领域的一个巨大进步，宏基因组，即一特定环境中所有为生物群落基因组的集合。目前的分子生物技术使构建环境总DNA文库成为可能，总DNA中也包括非培养微生物的基因组，这无疑为发现新颖、独特的未知酶类的广阔领域又打开了一扇新窗，因此宏基因组学方法筛选到的新酶数量，也将很快超过经传统方法获得的酶数。“宏基因组”通过研究直接从环境样品微生物提取出总DNA,然后这个将DNA克隆成容易培养细菌[5,6]向剩余99%不可培养的微生物打开另一扇门。显而易见，用宏基因组文库开发新生物催化剂的研究主要集中于小分子酶类的发现，而羧酸酯酶正在其中。
酯酶(EC 3.1.1.1)是分解脂肪的酶,主要催化短链酯化合物的水解和合成[7,8]。各种各样的酯酶已被确定来自不同环境样品[912]宏基因组库。羧酸酯酶和真脂肪酶在世界工业酶市场代表了一大部分有较高增长潜力的候选酶。酯酶,这种生物催化剂被广泛使用于很多方面,如营养、洗涤剂生产、化妆品、和天然产品修改[1315]等：通过修饰食用动植物油以改善其营养结构及感官质量；在造纸工业中，脂质水解酶可以除去纸浆中存在的沥青；可以作为洗涤剂中的活性添加物，或是用来合成生物高分子物质、产生生化柴油、合成光学纯的化合物和在医药领域受关注的活性化合物（如抗生素、抗炎症药物）、生产农业化肥（除草剂、杀虫剂）及进行生物降解处理等。
本课题方法简单、快速以及具有高重复性等特点，旨在直接从非培养的土壤微生物中提取总DNA，构建宏基因组文库。土壤是抗生素、生物催化剂等天然活性物质的主要来源，利用土壤宏基因组学方法已经筛选出了一些独特的新酶，这些酶也在一定程度上得到了应用。采用构建高质量土壤宏基因文库的方法对寻求土壤微生物资源最大限度挖掘、可持续开发利用有深远影响。
同时，我们将这种宏基因组文库筛选方法在酯酶的开发中运用，构建宏基因组DNA样本，筛选资源库，并从中探索和挖掘新酯酶基因，并且使从异源表达和定向进化获得的、具有优良性状的酯酶，对促进工业化发展和经济增长做出重要的贡献。
羧酸酯酶的裂解和纯化
1 实验材料
1．1 菌株与载体
表达宿主：E. coli BL21 (DE3) 由天然活性物质开发课题组保存。
表达载体：pET28a(+) 由天然活性物质开发课题组双酶切、去磷酸化处理后保存。
克隆载体：pTG19Tvector
1．2 酶及生化试剂
（1）亲和层析填料：Profinity IMAC NiCharged Resin。
（2）生化试剂：Tris Base，EDTA， SDS，TEMED，过硫酸铵，丙烯酰胺，考马斯亮蓝 R250，乙醇，冰乙酸；
NiCl2等其它化学试剂均为国产分析纯。
（3）抗生素：卡那霉素（Kanamycin）
1．3常用溶液配制
蛋白纯化缓冲液按下表配置：
体积(mL)
名称
NaCl(g)
Tris(g)
咪唑(g)
EDTA(g)
NiCl2(g)
1000
Washing buffer
5.8
6.0
0
0
0
1000
Elution buffer
5.8
6.0
34.0
0
目录
摘 要1
ABSTRACT1
引言 1
第一章 羧酸酯酶的裂解和纯化 2
1 实验材料 2
1.1 菌株与载体 2
1.2 酶及生化试剂 2
1.3 常用溶液配制 2
1.4 实验仪器 3
2 实验方法 3
2.1 重组酯酶的裂解及亲和层析纯化 3
2.2重组酯酶进一步纯化和酶活验证 4
2.3重组酯酶的SDSPAGE 凝胶检测 4
3 实验结果分析 4
4 讨论 5
第二章 重组羧酸酯酶EstGX3酶学性质表征 6
1 实验材料 6
1.1 酶及化学试剂 6
1.2 常用溶液配制 6
1.3 实验仪器 6
2 实验方法 7
2.1 酯酶EstGX3的活力测定 7
2.2 酶促反应时间研究 7
2.3 不同温度对EstGX3活性的影响 7
2.4 不同pH对EstGX3活性的影响 7
2.5不同浓度的EDTA以及不同类型的金属离子对EstGX3酶活影响的测定 7
2.6 有机溶剂EstGX3酶活的影响 8
3 实验结果分析 8
3.1 EstGX3的最适温度测定 8
3.2 EstGX3的最适pH测定 8
3.3 不同浓度EDTA以及不同类型金属离子金属离子对EstGX3酶活影响的测定 9
3.4 不同有机溶剂对EstGX3酶活
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: *351916072*
影响的测定 10
4 讨论 10
致谢 11
参考文献 11
宏基因组文库中新型酯酶功能的筛选及其鉴定分析
引言
引言
土壤微生物已经成为发现新的酶和多元活性次生代谢产物[1,2]的一个重要来源。然而,从正常基于培养微生物的方法得到新基因产物的难度持续上升,因为大多数微生物((99%)在目前实验室条件[3]不可培养。广阔的不可培养的微生物代表一个待探索的大基因库[4]。
宏基因组学时代的到来，意味着此领域的一个巨大进步，宏基因组，即一特定环境中所有为生物群落基因组的集合。目前的分子生物技术使构建环境总DNA文库成为可能，总DNA中也包括非培养微生物的基因组，这无疑为发现新颖、独特的未知酶类的广阔领域又打开了一扇新窗，因此宏基因组学方法筛选到的新酶数量，也将很快超过经传统方法获得的酶数。“宏基因组”通过研究直接从环境样品微生物提取出总DNA,然后这个将DNA克隆成容易培养细菌[5,6]向剩余99%不可培养的微生物打开另一扇门。显而易见，用宏基因组文库开发新生物催化剂的研究主要集中于小分子酶类的发现，而羧酸酯酶正在其中。
酯酶(EC 3.1.1.1)是分解脂肪的酶,主要催化短链酯化合物的水解和合成[7,8]。各种各样的酯酶已被确定来自不同环境样品[912]宏基因组库。羧酸酯酶和真脂肪酶在世界工业酶市场代表了一大部分有较高增长潜力的候选酶。酯酶,这种生物催化剂被广泛使用于很多方面,如营养、洗涤剂生产、化妆品、和天然产品修改[1315]等：通过修饰食用动植物油以改善其营养结构及感官质量；在造纸工业中，脂质水解酶可以除去纸浆中存在的沥青；可以作为洗涤剂中的活性添加物，或是用来合成生物高分子物质、产生生化柴油、合成光学纯的化合物和在医药领域受关注的活性化合物（如抗生素、抗炎症药物）、生产农业化肥（除草剂、杀虫剂）及进行生物降解处理等。
本课题方法简单、快速以及具有高重复性等特点，旨在直接从非培养的土壤微生物中提取总DNA，构建宏基因组文库。土壤是抗生素、生物催化剂等天然活性物质的主要来源，利用土壤宏基因组学方法已经筛选出了一些独特的新酶，这些酶也在一定程度上得到了应用。采用构建高质量土壤宏基因文库的方法对寻求土壤微生物资源最大限度挖掘、可持续开发利用有深远影响。
同时，我们将这种宏基因组文库筛选方法在酯酶的开发中运用，构建宏基因组DNA样本，筛选资源库，并从中探索和挖掘新酯酶基因，并且使从异源表达和定向进化获得的、具有优良性状的酯酶，对促进工业化发展和经济增长做出重要的贡献。
羧酸酯酶的裂解和纯化
1 实验材料
1．1 菌株与载体
表达宿主：E. coli BL21 (DE3) 由天然活性物质开发课题组保存。
表达载体：pET28a(+) 由天然活性物质开发课题组双酶切、去磷酸化处理后保存。
克隆载体：pTG19Tvector
1．2 酶及生化试剂
（1）亲和层析填料：Profinity IMAC NiCharged Resin。
（2）生化试剂：Tris Base，EDTA， SDS，TEMED，过硫酸铵，丙烯酰胺，考马斯亮蓝 R250，乙醇，冰乙酸；
NiCl2等其它化学试剂均为国产分析纯。
（3）抗生素：卡那霉素（Kanamycin）
1．3常用溶液配制
蛋白纯化缓冲液按下表配置：
体积(mL)
名称
NaCl(g)
Tris(g)
咪唑(g)
EDTA(g)
NiCl2(g)
1000
Washing buffer
5.8
6.0
0
0
0
1000
Elution buffer
5.8
6.0
34.0
0
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