天然低共熔溶剂对微生物的保护作用
摘要：乳酸菌是一类重要的微生物，常常用作发酵剂及益生菌制品。冷冻干燥保藏是制备高效发酵剂常用的技术手段之一，但是冻干过程不可避免地会造成部分乳酸菌损伤，甚至死亡。多年来，如何提高乳酸菌冷冻干燥后的活力，一直是乳酸菌冷冻干燥研究的重点。天然低共熔溶剂（NADES）是低共熔溶剂的一种，被认为是一种新型的可持续发展的溶剂，对微生物有保护作用。基于此，本文以嗜热链球菌和干酪乳杆菌为研究对象，研究其在不同的NADES中和在不同的保藏条件下的菌体存活率。结果表明：对于嗜热链球菌，冷冻保藏24h和1个月，50%的CC/Xyl保护作用最佳，存活率分别为461.11%和412.00%；对于干酪乳杆菌，冷冻保藏24h和1个月，80%的CC/Xyl的保护作用最佳，存活率分别为167.33%和175.00%。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1 材料与方法2
1.1 实验材料 2
1.1.1 主要材料2
1.1.2 主要试剂2
1.1.3 主要仪器和设备2
1.2 实验方法2
1.2.1 嗜热链球菌生长曲线的测定2
1.2.1.1 种子液的培养2
1.2.1.2 扩大培养2
1.2.1.3 吸光值的测定2
1.2.2 干酪乳杆菌生长曲线的测定3
1.2.2.1 种子液的培养3
1.2.2.2 扩大培养3
1.2.2.3 吸光值的测定3
1.2.3 NADES对嗜热链球菌的保护作用3
1.2.3.1 菌悬液的制备3
1.2.3.2 保护剂的添加3
1.2.3.3 冷冻保藏3
1.2.3.4 菌落总数的测定3
1.2.3.5 存活率的计算3
1.2.4 NADES对干酪乳杆菌的保护作用3
1.2.4.1 菌悬液的制备3
1.2.4.2 保护剂的添加4
1.2.4.3 冷冻保藏4
1.2.4.4 菌落总数的测定4
1.
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^3^5^1^9^1^6^0^7^2^*
2.4.5 存活率的计算4
2 结果与分析4
2.1 嗜热链球菌的生长曲线4
2.2 干酪乳杆菌的生长曲线5
2.3 NADES对嗜热链球菌（16%菌液）的保护作用5
2.3.1 嗜热链球菌在84%NADES的保护下冷冻前后的菌落总数5
2.3.2 嗜热链球菌在84%NADES的保护下的存活率6
2.4 NADES对嗜热链球菌（50%菌液）的保护作用6
2.4.1 嗜热链球菌在50%NADES的保护下冷冻前后的菌落总数6
2.4.2 嗜热链球菌在50%NADES的保护下的存活率8
2.5 NADES对干酪乳杆菌（20%菌液）的保护作8
2.5.1 干酪乳杆菌在80%NADES的保护下冷冻前后的菌落总数8
2.5.2 干酪乳杆菌在80%NADES的保护下的存活率8
2.6 NADES对干酪乳杆菌（50%菌液）的保护作9
2.6.1 干酪乳杆菌在50%NADES的保护下冷冻前后的菌落总数9
2.6.2 干酪乳杆菌在50%NADES的保护下的存活率9
3 讨论10
致谢10
参考文献10
附录11
天然低共熔溶剂对微生物的保护作用
引言
天然低共熔溶剂（NADES）是低共熔溶剂的一种，被认为是一种新型的符合可持续发展的溶剂。天然低共熔溶剂是由天然的、可降解的、廉价的化合物通过氢键结合形成的，原则上可以通过氢键供体和氢键受体的结合形成[1]。天然低共熔溶剂可以通过各种不同的化合物形成，如氯化胆碱、尿素、有机酸、多元醇和糖类[2]。这些合成低共熔液体的化合物有些甚至可以直接服用，因此对食品和医药工业具有很重要的应用。
低共熔液既保留了离子液体的优点，而且比离子液体更环保，低共熔溶剂制备时只涉及加热步骤也不需要进一步的纯化。因此，通常天然低共熔溶剂比离子液体更加安全、无毒副作用[3]。天然低共熔溶剂在各个科技领域都引起了很大的重视。其中最具影响力的应用就是加工萃取领域，因为在医药和生化工业中十分需要能够绿色有效的萃取天然产物的溶剂[4]。电化学、材料制备和合成三个应用领域就占总出版物的几乎四分之三。剩下的应用领域分布在催化（2.9%）和生物应用（11.4%）方面，包括生物催化、酶反应、生物材料或其它生物转化和分离过程[5]。然而，天然低共熔溶剂对微生物的保藏作用的研究却很少。
乳酸菌是指发酵糖类，主要产物为乳酸的一类无芽孢、革兰氏染色阳性细菌。乳酸菌的应用历史非常悠久，远在古代，人类就在食品酿造与加工上应用了乳酸菌。近些年来，由于确认了乳酸菌尤其是双歧杆菌、嗜酸乳杆菌等肠道有益菌的许多重要生理功能，各种乳酸菌发酵制品由此风靡世界。目前，国内菌种保藏材料上仍多采用明胶片、滤纸片、乳类、糖类、液体中药等；保藏技术和方法上仍以低温或超低温冷冻冷藏等为主[6]。乳酸菌的实验室保藏经常用到的有甘油保藏和脱脂乳的冷冻干燥保藏[7]。冷冻干燥保藏是制备高效发酵剂常用的技术手段之一，但是冻干过程不可避免地会造成部分乳酸菌损伤，甚至死亡[8]。多年以来，如何提高乳酸菌冷冻干燥后的活力，一直是乳酸菌冷冻干燥研究的重点[8]。
因此，本文以常用的嗜热链球菌和干酪乳杆菌作为乳酸菌的代表菌种，研究其在不同的天然低共熔溶剂和不同的冷冻条件下的存活率。主要涉及嗜热链球菌和干酪乳杆菌生长曲线的测定、不同天然低共熔溶剂的制备、存活率的测定等主要环节，旨在筛选出不同菌种在不同培养条件下的最适保护剂。
1 材料与方法
1．1 实验材料
1.1.1 主要材料
主要供试菌株：嗜热链球菌CICC20364(Streptococcus thermophilus)，干酪乳杆菌CICC20266(Latobacillus casei)。
主要培养基：MRS肉汤培养基，MRS固体培养基。
1.1.1 主要试剂
木糖醇，氯化胆碱（www.aladdine.com），乙二醇，L脯氨酸，葡萄糖（国药集团化学试剂有限公司），甘油，山梨糖醇，磷酸二氢钾（国药集团化学试剂有限公司），十二水合磷酸氢二钠（南京化学试剂有限公司），MRS肉汤（上海盛思生化科技有限公司），琼脂（Beijing Solarbio Science&Technology Co.Ltd），其他试剂均为分析纯。
1.1.1 主要仪器和设备
单人净化工作台（SWCJ1D型，名牌之星），紫外分光光度计（LabTech），气浴恒温振荡器（SHZ82A，科析仪器），回旋式气浴恒温振荡器（SHZ82（A），科析仪器），冰箱（BCD215KS，海尔），电子天平（浙制00000733号，华纳），数显恒温水浴锅（HH1，科析仪器），高速冷冻离心机（Avanti J30I），冰箱（BCD226UN，Hisense），立式压力蒸汽灭菌锅（LDZX50KBS），电热鼓风干燥箱，磁力加热搅拌器（781），培养箱，涡旋振荡器（VORTEX5）。
1．2 实验方法
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1 材料与方法2
1.1 实验材料 2
1.1.1 主要材料2
1.1.2 主要试剂2
1.1.3 主要仪器和设备2
1.2 实验方法2
1.2.1 嗜热链球菌生长曲线的测定2
1.2.1.1 种子液的培养2
1.2.1.2 扩大培养2
1.2.1.3 吸光值的测定2
1.2.2 干酪乳杆菌生长曲线的测定3
1.2.2.1 种子液的培养3
1.2.2.2 扩大培养3
1.2.2.3 吸光值的测定3
1.2.3 NADES对嗜热链球菌的保护作用3
1.2.3.1 菌悬液的制备3
1.2.3.2 保护剂的添加3
1.2.3.3 冷冻保藏3
1.2.3.4 菌落总数的测定3
1.2.3.5 存活率的计算3
1.2.4 NADES对干酪乳杆菌的保护作用3
1.2.4.1 菌悬液的制备3
1.2.4.2 保护剂的添加4
1.2.4.3 冷冻保藏4
1.2.4.4 菌落总数的测定4
1.
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^3^5^1^9^1^6^0^7^2^*
2.4.5 存活率的计算4
2 结果与分析4
2.1 嗜热链球菌的生长曲线4
2.2 干酪乳杆菌的生长曲线5
2.3 NADES对嗜热链球菌（16%菌液）的保护作用5
2.3.1 嗜热链球菌在84%NADES的保护下冷冻前后的菌落总数5
2.3.2 嗜热链球菌在84%NADES的保护下的存活率6
2.4 NADES对嗜热链球菌（50%菌液）的保护作用6
2.4.1 嗜热链球菌在50%NADES的保护下冷冻前后的菌落总数6
2.4.2 嗜热链球菌在50%NADES的保护下的存活率8
2.5 NADES对干酪乳杆菌（20%菌液）的保护作8
2.5.1 干酪乳杆菌在80%NADES的保护下冷冻前后的菌落总数8
2.5.2 干酪乳杆菌在80%NADES的保护下的存活率8
2.6 NADES对干酪乳杆菌（50%菌液）的保护作9
2.6.1 干酪乳杆菌在50%NADES的保护下冷冻前后的菌落总数9
2.6.2 干酪乳杆菌在50%NADES的保护下的存活率9
3 讨论10
致谢10
参考文献10
附录11
天然低共熔溶剂对微生物的保护作用
引言
天然低共熔溶剂（NADES）是低共熔溶剂的一种，被认为是一种新型的符合可持续发展的溶剂。天然低共熔溶剂是由天然的、可降解的、廉价的化合物通过氢键结合形成的，原则上可以通过氢键供体和氢键受体的结合形成[1]。天然低共熔溶剂可以通过各种不同的化合物形成，如氯化胆碱、尿素、有机酸、多元醇和糖类[2]。这些合成低共熔液体的化合物有些甚至可以直接服用，因此对食品和医药工业具有很重要的应用。
低共熔液既保留了离子液体的优点，而且比离子液体更环保，低共熔溶剂制备时只涉及加热步骤也不需要进一步的纯化。因此，通常天然低共熔溶剂比离子液体更加安全、无毒副作用[3]。天然低共熔溶剂在各个科技领域都引起了很大的重视。其中最具影响力的应用就是加工萃取领域，因为在医药和生化工业中十分需要能够绿色有效的萃取天然产物的溶剂[4]。电化学、材料制备和合成三个应用领域就占总出版物的几乎四分之三。剩下的应用领域分布在催化（2.9%）和生物应用（11.4%）方面，包括生物催化、酶反应、生物材料或其它生物转化和分离过程[5]。然而，天然低共熔溶剂对微生物的保藏作用的研究却很少。
乳酸菌是指发酵糖类，主要产物为乳酸的一类无芽孢、革兰氏染色阳性细菌。乳酸菌的应用历史非常悠久，远在古代，人类就在食品酿造与加工上应用了乳酸菌。近些年来，由于确认了乳酸菌尤其是双歧杆菌、嗜酸乳杆菌等肠道有益菌的许多重要生理功能，各种乳酸菌发酵制品由此风靡世界。目前，国内菌种保藏材料上仍多采用明胶片、滤纸片、乳类、糖类、液体中药等；保藏技术和方法上仍以低温或超低温冷冻冷藏等为主[6]。乳酸菌的实验室保藏经常用到的有甘油保藏和脱脂乳的冷冻干燥保藏[7]。冷冻干燥保藏是制备高效发酵剂常用的技术手段之一，但是冻干过程不可避免地会造成部分乳酸菌损伤，甚至死亡[8]。多年以来，如何提高乳酸菌冷冻干燥后的活力，一直是乳酸菌冷冻干燥研究的重点[8]。
因此，本文以常用的嗜热链球菌和干酪乳杆菌作为乳酸菌的代表菌种，研究其在不同的天然低共熔溶剂和不同的冷冻条件下的存活率。主要涉及嗜热链球菌和干酪乳杆菌生长曲线的测定、不同天然低共熔溶剂的制备、存活率的测定等主要环节，旨在筛选出不同菌种在不同培养条件下的最适保护剂。
1 材料与方法
1．1 实验材料
1.1.1 主要材料
主要供试菌株：嗜热链球菌CICC20364(Streptococcus thermophilus)，干酪乳杆菌CICC20266(Latobacillus casei)。
主要培养基：MRS肉汤培养基，MRS固体培养基。
1.1.1 主要试剂
木糖醇，氯化胆碱（www.aladdine.com），乙二醇，L脯氨酸，葡萄糖（国药集团化学试剂有限公司），甘油，山梨糖醇，磷酸二氢钾（国药集团化学试剂有限公司），十二水合磷酸氢二钠（南京化学试剂有限公司），MRS肉汤（上海盛思生化科技有限公司），琼脂（Beijing Solarbio Science&Technology Co.Ltd），其他试剂均为分析纯。
1.1.1 主要仪器和设备
单人净化工作台（SWCJ1D型，名牌之星），紫外分光光度计（LabTech），气浴恒温振荡器（SHZ82A，科析仪器），回旋式气浴恒温振荡器（SHZ82（A），科析仪器），冰箱（BCD215KS，海尔），电子天平（浙制00000733号，华纳），数显恒温水浴锅（HH1，科析仪器），高速冷冻离心机（Avanti J30I），冰箱（BCD226UN，Hisense），立式压力蒸汽灭菌锅（LDZX50KBS），电热鼓风干燥箱，磁力加热搅拌器（781），培养箱，涡旋振荡器（VORTEX5）。
1．2 实验方法
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