产类细菌素乳酸菌的筛选及抗菌特性研究(附件)
细菌素是由某些细菌在代谢过程中通过核糖体产生的一类具有生物活性的蛋白质、多肽或前体多肽, 其可抑制致病性及腐败微生物的生长。本研究分别从泡菜和牛奶中初筛到5株乳酸菌，以大肠杆菌(Escherichia coli)、金黄葡萄球菌(Staphylococcus aureus)为指示菌，研究其抑菌特性。结果发现5株初筛乳酸菌中有两菌株的发酵上清液对指示菌具有较明显抑菌效果。经形态学、生理生化特征及16S rDNA序列同源性分析等手段鉴定这两株菌分别为发酵乳杆菌和植物乳杆菌。有机酸、过氧化氢排除试验以及蛋白酶敏感试验结果初步显示发酵上清中存在的抑菌物质主要为类细菌素，该类细菌素对部分革兰阴性菌、革兰阳性菌有较好的抑菌效果。本研究结果为开发新型类细菌素及其在食品工业的应用提供了丰富的理论基础。关键词 乳酸菌，类细菌素，16s rRNA，抑菌特性
目 录
1 引言 1
1.1 乳酸菌 1
1.2 乳酸菌细菌素 2
1.3 乳酸菌类细菌素 2
1.4 产类细菌素乳酸菌的研究进展 3
1.5 本课题研究的目的和意义 4
2 材料与方法 4
2.1 试验材料和药品 4
2.2 仪器和设备 6
2.3 实验方法 6
3 结果与分析 12
3.1 乳酸菌的筛选 12
3.2 抑菌结果 13
3.3 乳酸菌的形态学鉴定 15
3.4 乳酸菌的生理生化鉴定 16
3.5 菌种的分子学鉴定与分析 18
结论 21
致 谢 22
参考文献 23
1 引言
我国幅员辽阔，食品种类丰富，分布广泛，具有充足的乳酸菌资源。在我国的西北部地区，人们依然采用古老而又传统的方法发酵制造各种乳制品，如青海的传统发酵山羊奶、内蒙古和新疆的酸驼乳。而泡菜是我国的传统食品之一，传统的发酵方法经过千百年的沉淀，在华夏这片土地上广为流传，丰富的泡菜资源也是蕴含各式各样乳酸菌的良好载体[1]。这不仅仅为了我们保存了许多有用的益生菌资源，更对于丰富我国膳食种类也发挥了重要作用。因而从各种食 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072*
品中筛选出具有稳定抑菌效果的产类细菌素乳酸菌，这对于促进我国食品工业的快速发展具有一定的实际意义[2]。
因此，如何分离筛选抑菌活性更稳定的乳酸菌，吸引了越来越多的科研人员的视线。目前为止，实现工业化生产与应用的乳酸菌只有Nisin，但Nisin的应用并不是十全十美，研究人员发现它的抑菌谱涉及范围并不是很宽，它只能在酸性食品中发挥它的抑菌效果，当它的pH大于8.0，它的抑菌活性大大降低甚至是失活[3]。且Nisin主要对革兰氏阳性菌有抑菌作用，而对革兰氏阴性菌的抑菌作用就相形见拙，在食品工业和医药业应用上受到了这些特性的限制[4]。类细菌素与细菌素相比，应用范围更为广泛。近年来，科研人员投入大量的精力研究乳酸菌的筛选分离，发现越来越多的新型乳酸菌，但很少能够对其进行更深入的研究，因此可以投入生产的具有抑菌作用的乳酸菌类细菌素更是少之又少[5]。由此可见，对新型类细菌素的研究和开发显得尤为重要。
1.1 乳酸菌
乳酸菌是一类具有革兰氏染色呈阳性、不形成芽孢、发酵糖类主要产物为乳酸等特征的兼性厌氧性细菌的总称。乳酸菌不是分类学上的规范名称，而对于乳酸菌的分类，目前还没有统一的定论，根据乳酸菌的菌落特征和生理生化特点分为大约18个属[6]。对于我们人体来说，它能够对胃肠道中的正常菌群进行一定程度的调节，从而使微环境呈现出一定的稳定性。在日常生活中，乳酸菌广泛的应用于各种食品中，列如乳酸菌饮料，发酵酸奶、干酪、面包加工以及发酵制品等，乳酸菌能赋予食品特殊的香醇和柔和的酸度、能够提高食品的保藏性和附加值、能够使食品的质地和营养得到改善，还具有抑制肠道内腐败菌生长繁殖和腐败产物的产生、降低血清胆固醇、控制内毒素、抗肿瘤、抗变异原和制造营养物质等重要生物学功能，且可以刺激组织发育，增强免疫力，这说明了乳酸菌不仅仅局限于食品工业的应用，它也能在医药品的开发、农业的生产领域发挥重大作用[7]。
1.2 乳酸菌细菌素
细菌素(Bacteriocin)是细菌在代谢过程中产生的具有一定抗菌或杀菌作用的物质。由于主要含具有生物活性的多肽或蛋白质类物质，它们附着在敏感细胞特异性受点上，进而只对同种近缘菌株有一定的抑菌效果，这也是不同于一般抗生素的主要原因。据目前的调查研究发现，细菌素是一种庞大而不均一物质，它们在分子量上大小不一、生理生化性质各异以及它们的作用机制、抑菌范围和遗传特性等均有各自的特点。所以，细菌素的定义现在还没有统一的定论，具体的定义在随着研究的不断深入也在不断的变化。但判断该类物质为细菌素有两个必需的共同点：一是它需具有蛋白质的一些特性；二是细菌素对其产生菌有自身免疫作用[8]。
细菌素可以被多种细菌产生，且通常情况下，细菌素是以其的生产菌而进行命名，如乳酸菌产生的细菌素被称为乳酸菌素[9]。乳酸菌是世界上众多科学家和研究者所公认的安全微生物和益生菌，早在几千年前，它就被我们古代智慧的劳动人民应用到许多食品发酵中。发展到二十一世纪，它的越来越多的生物活性被发现、研究，成为有广大应用前景的绿色食品防腐剂和饲料添加剂[10]。
1.3 乳酸菌类细菌素
随着研究的不断深入，研究者们发现由于乳酸菌细菌素的理化及生物学特性，在一定条件下限制了其的广泛应用。乳酸菌细菌素通常具有较为狭窄的抑菌谱，只能抑制其亲缘关系较近的乳酸菌及非乳酸菌的革兰氏阳性菌，对于革兰氏阴性菌和真菌的抑菌效果较差，或者几乎没有[11]。而细菌产生的类细菌素是一种可以对较多的微生物有抑菌、防腐作用的活性物质，它的稳定性在较宽范围的pH范围内都有效、能够对真菌、革兰氏阴性菌等都有一定的抑菌作用。而它所具有这些特性就决定了类细菌素比细菌素能够应用的更广泛[12]。因此，类细菌素在食品工业中扮演了越来越重要的角色，近年来越来越受到人们的重视以及在各个有关行业得到广泛应用。目前国内外关于乳酸菌细菌素的研究已经到了分子水平，而对于乳酸菌类细菌素的研究尚少，已经发现的能产生类细菌素的乳酸菌的种属有乳杆菌属、乳球菌属、乳链球菌属等，但仍需要更多的研究者和更多的财力精力去探索、去发现[13]。
目 录
1 引言 1
1.1 乳酸菌 1
1.2 乳酸菌细菌素 2
1.3 乳酸菌类细菌素 2
1.4 产类细菌素乳酸菌的研究进展 3
1.5 本课题研究的目的和意义 4
2 材料与方法 4
2.1 试验材料和药品 4
2.2 仪器和设备 6
2.3 实验方法 6
3 结果与分析 12
3.1 乳酸菌的筛选 12
3.2 抑菌结果 13
3.3 乳酸菌的形态学鉴定 15
3.4 乳酸菌的生理生化鉴定 16
3.5 菌种的分子学鉴定与分析 18
结论 21
致 谢 22
参考文献 23
1 引言
我国幅员辽阔，食品种类丰富，分布广泛，具有充足的乳酸菌资源。在我国的西北部地区，人们依然采用古老而又传统的方法发酵制造各种乳制品，如青海的传统发酵山羊奶、内蒙古和新疆的酸驼乳。而泡菜是我国的传统食品之一，传统的发酵方法经过千百年的沉淀，在华夏这片土地上广为流传，丰富的泡菜资源也是蕴含各式各样乳酸菌的良好载体[1]。这不仅仅为了我们保存了许多有用的益生菌资源，更对于丰富我国膳食种类也发挥了重要作用。因而从各种食 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072*
品中筛选出具有稳定抑菌效果的产类细菌素乳酸菌，这对于促进我国食品工业的快速发展具有一定的实际意义[2]。
因此，如何分离筛选抑菌活性更稳定的乳酸菌，吸引了越来越多的科研人员的视线。目前为止，实现工业化生产与应用的乳酸菌只有Nisin，但Nisin的应用并不是十全十美，研究人员发现它的抑菌谱涉及范围并不是很宽，它只能在酸性食品中发挥它的抑菌效果，当它的pH大于8.0，它的抑菌活性大大降低甚至是失活[3]。且Nisin主要对革兰氏阳性菌有抑菌作用，而对革兰氏阴性菌的抑菌作用就相形见拙，在食品工业和医药业应用上受到了这些特性的限制[4]。类细菌素与细菌素相比，应用范围更为广泛。近年来，科研人员投入大量的精力研究乳酸菌的筛选分离，发现越来越多的新型乳酸菌，但很少能够对其进行更深入的研究，因此可以投入生产的具有抑菌作用的乳酸菌类细菌素更是少之又少[5]。由此可见，对新型类细菌素的研究和开发显得尤为重要。
1.1 乳酸菌
乳酸菌是一类具有革兰氏染色呈阳性、不形成芽孢、发酵糖类主要产物为乳酸等特征的兼性厌氧性细菌的总称。乳酸菌不是分类学上的规范名称，而对于乳酸菌的分类，目前还没有统一的定论，根据乳酸菌的菌落特征和生理生化特点分为大约18个属[6]。对于我们人体来说，它能够对胃肠道中的正常菌群进行一定程度的调节，从而使微环境呈现出一定的稳定性。在日常生活中，乳酸菌广泛的应用于各种食品中，列如乳酸菌饮料，发酵酸奶、干酪、面包加工以及发酵制品等，乳酸菌能赋予食品特殊的香醇和柔和的酸度、能够提高食品的保藏性和附加值、能够使食品的质地和营养得到改善，还具有抑制肠道内腐败菌生长繁殖和腐败产物的产生、降低血清胆固醇、控制内毒素、抗肿瘤、抗变异原和制造营养物质等重要生物学功能，且可以刺激组织发育，增强免疫力，这说明了乳酸菌不仅仅局限于食品工业的应用，它也能在医药品的开发、农业的生产领域发挥重大作用[7]。
1.2 乳酸菌细菌素
细菌素(Bacteriocin)是细菌在代谢过程中产生的具有一定抗菌或杀菌作用的物质。由于主要含具有生物活性的多肽或蛋白质类物质，它们附着在敏感细胞特异性受点上，进而只对同种近缘菌株有一定的抑菌效果，这也是不同于一般抗生素的主要原因。据目前的调查研究发现，细菌素是一种庞大而不均一物质，它们在分子量上大小不一、生理生化性质各异以及它们的作用机制、抑菌范围和遗传特性等均有各自的特点。所以，细菌素的定义现在还没有统一的定论，具体的定义在随着研究的不断深入也在不断的变化。但判断该类物质为细菌素有两个必需的共同点：一是它需具有蛋白质的一些特性；二是细菌素对其产生菌有自身免疫作用[8]。
细菌素可以被多种细菌产生，且通常情况下，细菌素是以其的生产菌而进行命名，如乳酸菌产生的细菌素被称为乳酸菌素[9]。乳酸菌是世界上众多科学家和研究者所公认的安全微生物和益生菌，早在几千年前，它就被我们古代智慧的劳动人民应用到许多食品发酵中。发展到二十一世纪，它的越来越多的生物活性被发现、研究，成为有广大应用前景的绿色食品防腐剂和饲料添加剂[10]。
1.3 乳酸菌类细菌素
随着研究的不断深入，研究者们发现由于乳酸菌细菌素的理化及生物学特性，在一定条件下限制了其的广泛应用。乳酸菌细菌素通常具有较为狭窄的抑菌谱，只能抑制其亲缘关系较近的乳酸菌及非乳酸菌的革兰氏阳性菌，对于革兰氏阴性菌和真菌的抑菌效果较差，或者几乎没有[11]。而细菌产生的类细菌素是一种可以对较多的微生物有抑菌、防腐作用的活性物质，它的稳定性在较宽范围的pH范围内都有效、能够对真菌、革兰氏阴性菌等都有一定的抑菌作用。而它所具有这些特性就决定了类细菌素比细菌素能够应用的更广泛[12]。因此，类细菌素在食品工业中扮演了越来越重要的角色，近年来越来越受到人们的重视以及在各个有关行业得到广泛应用。目前国内外关于乳酸菌细菌素的研究已经到了分子水平，而对于乳酸菌类细菌素的研究尚少，已经发现的能产生类细菌素的乳酸菌的种属有乳杆菌属、乳球菌属、乳链球菌属等，但仍需要更多的研究者和更多的财力精力去探索、去发现[13]。
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