酶法提取河蚬多糖的工艺优化
酶法提取河蚬多糖的工艺优化[20200408172329]
摘 要
目的:优化酶法提取河蚬多糖的工艺参数。方法:在单因素实验的基础上，利用Box-Behnken设计实验法，研究料液比、pH、提取温度、酶添加量对多糖提取率的影响。结果:河蚬多糖的最佳提取工艺条件为料液比为1:40，pH为9.3，酶添加量为3.0%，温度为50℃，提取时间为2h。在此条件下测得多糖提取率为4.670%。结论:用响应面实验能够优化河蚬多糖的酶法提取工艺，提高得率。
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关键字:河蚬多糖提取
目 录
1 绪论 1
1.1 河蚬 1
1.2 多糖及多糖的来源 1
1.3 多糖的提取方法 1
1.4 研究的背景和意义 2
2 实验材料与方法 3
2.1 实验材料与试剂 3
2.2 实验方法 4
2.2.1 葡萄糖标准曲线的制作 4
2.2.2 河蚬粉末的制备 5
2.2.3 河蚬多糖提取与提取率的测定 5
2.3 单因素实验 5
2.3.1 料液比对河蚬多糖提取率的影响 5
2.3.2 pH值对河蚬多糖提取率的影响 6
2.3.3 酶添加量对河蚬多糖提取率的影响 6
2.3.4 提取温度对河蚬多糖提取率的影响 6
2.3.5 提取时间对河蚬多糖提取率的影响 6
2.4 河蚬多糖提取响应面法实验 6
3 结果分析 7
3.1 各项单因素对河蚬多糖提取率的影响 7
3.1.1 料液比对河蚬多糖提取率的影响 7
3.1.2 pH值对河蚬多糖提取率的影响 7
3.1.3 酶添加量对河蚬多糖提取率的影响 8
3.1.4 提取温度对河蚬多糖提取率的影响 8
3.1.5 提取时间对河蚬多糖提取率的影响 9
3.2 响应面法提取河蚬多糖的试验结果与分析 10
4 总结 19
参考文献 20
致谢 22
1 绪论
1.1 河蚬
河蚬（Corbicula fluminea）是双壳类软体动物，又称黄蚬、扁螺、金蚶等，常栖息于咸淡水的湖泊、江河以及入海口等地方，由于生长环境不同，其贝壳通常可以形成黄色以及黑色，原产地在我国，现如今世界各地的水域也广泛分布。河蚬的繁殖能力强，生长速度快，养殖产量大，同时资源也非常丰富。河蚬味道鲜美，营养丰富，其具有非常高的保健作用以及食用价值。河蚬作为重要的药材可以开胃、明目、利尿、通乳、去湿毒、解酒、治疗肝病、麻疹、退热、止咳化痰等 [1], 此外经过粉碎的蚬肉、蚬壳配入混合饲料 还可以作为鱼类与禽畜类的饵料，饲喂禽畜能够促进它们的生长繁殖，同时还可提高禽类产蛋率、畜类产乳率等。
1.2 多糖及多糖的来源
多糖(polysaccharides),又称作多聚糖，是一种十个以上单糖通过糖苷键连接而成的多聚糖，多聚糖的分子量通常在数万至数百万范围内[2]，维持生命所需的多种生理功能和多糖都是紧密相关的。多糖是极性大分子化合物, 易溶于水, 不溶于乙醇。多糖通常分为五大类，分别为细菌多糖、藻类多糖、真菌多糖、动物多糖以及植物多糖。
河蚬中的多糖属于动物多糖，其中动物多糖分为糖原、甲壳素和酸性粘多糖等，动物的组织器官中为主要的分布场所。Murry的研究显示[3]，许多海洋动物中含具有生物活性的多糖类物质，比如虾、蟹、乌贼、海星、刺参等的某些组织器官中含有多糖，这也引起许多学者的关注，引来更多的学者研究动物多糖。近年来很多学者又从贝类、鲍鱼、蚕蛹、泥鳅、中国林蛙等动物中提取分离出了具有生物活性的动物多糖。
1.3 多糖的提取方法
多糖属于极性大分子化合物，大多可以采用不同温度的水、稀碱溶液提取，此外应尽量避免在酸性条件下提取，因为在酸性条件下会引起糖苷键的断裂。稀酸提取时，时间宜短、温度不宜超过50℃。酶法提取多糖是通过酶反应将原料组织分解,加速被提取主体有效成分的释放和提取,同时选择适宜条件将能影响提取的杂质分解除去,以此促进一些极性低的脂溶性成分转化成糖苷类易溶于水的成分,从而降低提取的难度。Ourdia Bouzid等人[4]运用了酶能够专一地水解酚类化合物和多糖之间的酯键。Hauke Hilz等人[5]应用酶分离得到更多的果胶多糖。这种方法具有条件温和、易去除杂质、回收率高和节约能耗等优点,因此酶法提取多糖的应用前景十分广阔。由于酶具有选择性和专一性的特性,所以应用时多采用复合酶。需要注意的是一组酶之间的协同关系、底物、抑制剂以及酶的浓度, 还要注意酶解设备与工艺参数,比如pH、温度、时间、粉碎作用和粉碎设备等。多糖易溶于水, 不溶于乙醇，常用的提取方法有热水浸提、稀碱液浸提法、稀酸液浸提法、超声抽提法、酶提法,以及超临界流体萃取法。由于多糖是由单糖基通过糖苷键连接而成的化合物,在稀酸、稀碱条件下, 多糖易发生糖苷键的断裂,部分多糖发生水解而使多糖的提取率减少[6]。
酶促反应具有高度的专一性,且副产物少,这也是分析糖链结构的一种重要手段。利用α-糖苷酶和β-糖苷酶对多糖底物的催化反应,可用于确认多糖链中糖苷键类型，也可用酶解的方法来分析糖肽连接方式[2]。
1.4 研究的背景和意义
目前有研究者已经从牡蛎[7]、文蛤[8]、河蚌[9]等软体动物中提取得到具有与植物多糖相似生理活性的多糖类化合物，此类化合物具有抗氧化、抗肿瘤、抗凝血、调节机体免疫力、抗心脑血管疾病等多种特殊抗病作用[10]，是一类比较理想的保健食品和药品的原料，因此也得到了很多学者的普遍关注，当然在保健食品和医药等行业中也得到了一定的应用，具有较广阔的发展前景。近些年，由于提取分离手段以及技术的不断进步，酶法提取多糖技术已得到广泛的应用。
响应面分析法(RSA)是在20世纪50年代由Box等人提出的一种优化工艺条件的有效方法[11]。响应面分析法将回归方程作为函数估算的工具，确定各因素及其交互作用对各指标的影响，并能够精确地表述因素与响应值之间的关系。目前，优化多糖提取工艺更多采用的是正交试验法，而响应面分析法优化多糖提取工艺的研究却相对而言比较少[12]。本次采用Box-Behnken设计法，通过考察关键工艺参数对河蚬多糖提取率的影响，以此来优化河蚬多糖的提取工艺，希望能够为产业化的提取河蚬多糖提供一个基础的理论依据和技术支持。
在我国，江苏省河蚬的养殖历史算得上悠久，在众多湖泊,尤其在太湖、洪泽湖、骆马湖等天然湖泊中的河蚬天然资源丰富，由于产自湖中无污染深水区域及捕捞的季节不同，河蚬壳呈现出金黄色，所以又有“黄金蚬”的美称。目前市场上，河蚬主要以鲜销为主，还可以制成蚬干、罐头、咸蚬等，此外有很大一部分河蚬肉经过速冻后出口到日韩以及东南亚地区一些国家。据报道，出口到韩国加工后河蚬的价格可以达到每吨十二万元人民币左右，然而从国内出口的鲜活河蚬的每吨价格大约也只有一千元人民币左右，这个过程中河蚬的附加值竟然被提高了近百倍[13]。除此之外，河蚬在初加工的过程中会形成河蚬汤汁，这些河蚬汤汁在韩国工厂中进行深加工后能卖出相当于食用油的价钱。由此看出，我国河蚬的鲜销和初级产品远没有发挥出其应有的潜在价值。不过令人欣喜的是，随着国家不断重视科技的发展以及生产力的提高，我国人工饲养技术的不断提高以及养殖业的迅猛发展，使得河蚬的产量能以逐年增长的趋势，这也为河蚬多糖的开发与综合利用提供了更加丰富的物质来源。
2 实验材料与方法
2.1 实验材料与试剂
实验材料:河蚬粉末(江苏省宿迁楠景水产品有限公司)；
碱性蛋白酶（NOVO分装，CAS:9014-01-1 ACT:200000u/g EXP:08/2014 上海奥宇生物科技有限公司）；
摘 要
目的:优化酶法提取河蚬多糖的工艺参数。方法:在单因素实验的基础上，利用Box-Behnken设计实验法，研究料液比、pH、提取温度、酶添加量对多糖提取率的影响。结果:河蚬多糖的最佳提取工艺条件为料液比为1:40，pH为9.3，酶添加量为3.0%，温度为50℃，提取时间为2h。在此条件下测得多糖提取率为4.670%。结论:用响应面实验能够优化河蚬多糖的酶法提取工艺，提高得率。
*查看完整论文请 +Q: 3 5 1 9 1 6 0 7 2
关键字:河蚬多糖提取
目 录
1 绪论 1
1.1 河蚬 1
1.2 多糖及多糖的来源 1
1.3 多糖的提取方法 1
1.4 研究的背景和意义 2
2 实验材料与方法 3
2.1 实验材料与试剂 3
2.2 实验方法 4
2.2.1 葡萄糖标准曲线的制作 4
2.2.2 河蚬粉末的制备 5
2.2.3 河蚬多糖提取与提取率的测定 5
2.3 单因素实验 5
2.3.1 料液比对河蚬多糖提取率的影响 5
2.3.2 pH值对河蚬多糖提取率的影响 6
2.3.3 酶添加量对河蚬多糖提取率的影响 6
2.3.4 提取温度对河蚬多糖提取率的影响 6
2.3.5 提取时间对河蚬多糖提取率的影响 6
2.4 河蚬多糖提取响应面法实验 6
3 结果分析 7
3.1 各项单因素对河蚬多糖提取率的影响 7
3.1.1 料液比对河蚬多糖提取率的影响 7
3.1.2 pH值对河蚬多糖提取率的影响 7
3.1.3 酶添加量对河蚬多糖提取率的影响 8
3.1.4 提取温度对河蚬多糖提取率的影响 8
3.1.5 提取时间对河蚬多糖提取率的影响 9
3.2 响应面法提取河蚬多糖的试验结果与分析 10
4 总结 19
参考文献 20
致谢 22
1 绪论
1.1 河蚬
河蚬（Corbicula fluminea）是双壳类软体动物，又称黄蚬、扁螺、金蚶等，常栖息于咸淡水的湖泊、江河以及入海口等地方，由于生长环境不同，其贝壳通常可以形成黄色以及黑色，原产地在我国，现如今世界各地的水域也广泛分布。河蚬的繁殖能力强，生长速度快，养殖产量大，同时资源也非常丰富。河蚬味道鲜美，营养丰富，其具有非常高的保健作用以及食用价值。河蚬作为重要的药材可以开胃、明目、利尿、通乳、去湿毒、解酒、治疗肝病、麻疹、退热、止咳化痰等 [1], 此外经过粉碎的蚬肉、蚬壳
1.2 多糖及多糖的来源
多糖(polysaccharides),又称作多聚糖，是一种十个以上单糖通过糖苷键连接而成的多聚糖，多聚糖的分子量通常在数万至数百万范围内[2]，维持生命所需的多种生理功能和多糖都是紧密相关的。多糖是极性大分子化合物, 易溶于水, 不溶于乙醇。多糖通常分为五大类，分别为细菌多糖、藻类多糖、真菌多糖、动物多糖以及植物多糖。
河蚬中的多糖属于动物多糖，其中动物多糖分为糖原、甲壳素和酸性粘多糖等，动物的组织器官中为主要的分布场所。Murry的研究显示[3]，许多海洋动物中含具有生物活性的多糖类物质，比如虾、蟹、乌贼、海星、刺参等的某些组织器官中含有多糖，这也引起许多学者的关注，引来更多的学者研究动物多糖。近年来很多学者又从贝类、鲍鱼、蚕蛹、泥鳅、中国林蛙等动物中提取分离出了具有生物活性的动物多糖。
1.3 多糖的提取方法
多糖属于极性大分子化合物，大多可以采用不同温度的水、稀碱溶液提取，此外应尽量避免在酸性条件下提取，因为在酸性条件下会引起糖苷键的断裂。稀酸提取时，时间宜短、温度不宜超过50℃。酶法提取多糖是通过酶反应将原料组织分解,加速被提取主体有效成分的释放和提取,同时选择适宜条件将能影响提取的杂质分解除去,以此促进一些极性低的脂溶性成分转化成糖苷类易溶于水的成分,从而降低提取的难度。Ourdia Bouzid等人[4]运用了酶能够专一地水解酚类化合物和多糖之间的酯键。Hauke Hilz等人[5]应用酶分离得到更多的果胶多糖。这种方法具有条件温和、易去除杂质、回收率高和节约能耗等优点,因此酶法提取多糖的应用前景十分广阔。由于酶具有选择性和专一性的特性,所以应用时多采用复合酶。需要注意的是一组酶之间的协同关系、底物、抑制剂以及酶的浓度, 还要注意酶解设备与工艺参数,比如pH、温度、时间、粉碎作用和粉碎设备等。多糖易溶于水, 不溶于乙醇，常用的提取方法有热水浸提、稀碱液浸提法、稀酸液浸提法、超声抽提法、酶提法,以及超临界流体萃取法。由于多糖是由单糖基通过糖苷键连接而成的化合物,在稀酸、稀碱条件下, 多糖易发生糖苷键的断裂,部分多糖发生水解而使多糖的提取率减少[6]。
酶促反应具有高度的专一性,且副产物少,这也是分析糖链结构的一种重要手段。利用α-糖苷酶和β-糖苷酶对多糖底物的催化反应,可用于确认多糖链中糖苷键类型，也可用酶解的方法来分析糖肽连接方式[2]。
1.4 研究的背景和意义
目前有研究者已经从牡蛎[7]、文蛤[8]、河蚌[9]等软体动物中提取得到具有与植物多糖相似生理活性的多糖类化合物，此类化合物具有抗氧化、抗肿瘤、抗凝血、调节机体免疫力、抗心脑血管疾病等多种特殊抗病作用[10]，是一类比较理想的保健食品和药品的原料，因此也得到了很多学者的普遍关注，当然在保健食品和医药等行业中也得到了一定的应用，具有较广阔的发展前景。近些年，由于提取分离手段以及技术的不断进步，酶法提取多糖技术已得到广泛的应用。
响应面分析法(RSA)是在20世纪50年代由Box等人提出的一种优化工艺条件的有效方法[11]。响应面分析法将回归方程作为函数估算的工具，确定各因素及其交互作用对各指标的影响，并能够精确地表述因素与响应值之间的关系。目前，优化多糖提取工艺更多采用的是正交试验法，而响应面分析法优化多糖提取工艺的研究却相对而言比较少[12]。本次采用Box-Behnken设计法，通过考察关键工艺参数对河蚬多糖提取率的影响，以此来优化河蚬多糖的提取工艺，希望能够为产业化的提取河蚬多糖提供一个基础的理论依据和技术支持。
在我国，江苏省河蚬的养殖历史算得上悠久，在众多湖泊,尤其在太湖、洪泽湖、骆马湖等天然湖泊中的河蚬天然资源丰富，由于产自湖中无污染深水区域及捕捞的季节不同，河蚬壳呈现出金黄色，所以又有“黄金蚬”的美称。目前市场上，河蚬主要以鲜销为主，还可以制成蚬干、罐头、咸蚬等，此外有很大一部分河蚬肉经过速冻后出口到日韩以及东南亚地区一些国家。据报道，出口到韩国加工后河蚬的价格可以达到每吨十二万元人民币左右，然而从国内出口的鲜活河蚬的每吨价格大约也只有一千元人民币左右，这个过程中河蚬的附加值竟然被提高了近百倍[13]。除此之外，河蚬在初加工的过程中会形成河蚬汤汁，这些河蚬汤汁在韩国工厂中进行深加工后能卖出相当于食用油的价钱。由此看出，我国河蚬的鲜销和初级产品远没有发挥出其应有的潜在价值。不过令人欣喜的是，随着国家不断重视科技的发展以及生产力的提高，我国人工饲养技术的不断提高以及养殖业的迅猛发展，使得河蚬的产量能以逐年增长的趋势，这也为河蚬多糖的开发与综合利用提供了更加丰富的物质来源。
2 实验材料与方法
2.1 实验材料与试剂
实验材料:河蚬粉末(江苏省宿迁楠景水产品有限公司)；
碱性蛋白酶（NOVO分装，CAS:9014-01-1 ACT:200000u/g EXP:08/2014 上海奥宇生物科技有限公司）；
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