河蚬肉酶解液抗氧化肽的分离及活性研究
河蚬肉酶解液抗氧化肽的分离及活性研究[20200408174236]
摘要
目的：分离河蚬肉酶解液中的抗氧化肽，对分离的各组分进行抗氧化性能测定，并分析各组分的分子量。方法：河蚬肉酶解后利用葡萄糖凝胶G-50进行分离纯化，并通过分光光度法对分离得到的抗氧化肽进行总抗氧化性、羟自由基清除能力、DPPH自由基清除能力进行测定。通过SDS-PAGE电泳技术分析各组分的分子量。结果：实验共分离出五种抗氧化肽，分别为F1、F2、F3、F4、F5。其中，F2的总抗氧化能力最强。组分F1、F3清除羟自由基能力较强分别为91.67%、83.33%，组分F2、F3清除DPPH自由基的能力较强分别为27.15%、26.35%。电泳得到组分S1、S2、S3、S4的分子量分别为86.9kD、65.7kD、18.9kD、3.6kD。结论：河蚬酶解液抗氧化肽的羟自由基清除能力突出，为河蚬抗氧化肽的进一步研究提供理论基础。
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关键字:河蚬葡萄糖凝胶G-50抗氧化肽自由基清除率电泳分子量
目 录
1 引言 1
2 材料与方法 3
2.1 实验材料 3
2.1.1 主要实验材料 3
2.1.2 试剂及药品 3
2.2 主要仪器设备 3
3 实验方法 4
3.1 河蚬肉酶解液的制备 4
3.1.1 操作要点 4
3.2 河蚬肉酶解液中抗氧化肽的分离纯化 4
3.3 各组分抗氧化性的测定 4
3.3.1 总抗氧化性的测定（三价铁离子还原力） 4
3.3.2 羟自由基的清除率的测定 5
3.3.3 DPPH自由基清除能力测定 5
3.4抗氧化肽的电泳分离 6
4 结果与分析 8
4.1 葡萄糖凝胶G-50分离河蚬肉酶解液 8
4.2 河蚬肉酶解液中抗氧化肽的抗氧化特性研究 9
4.2.1 总抗氧化活性测定 9
4.2.2 羟自由基清除能力的测定 10
4.2.3 清除DPPH自由基能力的测定 11
4.3 河蚬肉酶解液中抗氧化肽的电泳 12
5 结论 14
参考文献 15
致 谢 16
1 引言
河蚬（Corbicula fluminea）是水生双壳类软体动物，生长在淡水或咸淡水的江河、湖泊及入海口，原产于我国，目前在世界各地水域均有广泛分布，它们生长速度快、繁殖能力强，养殖方法简单，资源极为丰富[1]。
河蚬味道鲜美，营养丰富，具有很高的食用价值和保健作用[2]。河蚬肉营养丰富，富含氨基酸、无机盐、不饱和脂肪酸、EPA和DHA。韩鹏[3]等对河蚬软体部分的营养成分进行了分析，结果表明：干样中, 粗蛋白含量为63.33%、粗脂肪含量为10.91%、灰分含量为6.29%，富含17种氨基酸，其中必需氨基酸占氨基酸总量的39.10%，并含有大量钙、钠、钾、镁、铁、锌、铜、锰等无机元素，与其他贝类相比，河蚬的蛋白质、多糖、脂肪含量均高于文蛤、贻贝、扇贝等。庄平[4]等通过对河蚬的营养成分进行分析，发现河蚬肉中还富含磷、铬、硒等矿物质。
近年来，国内外对双壳贝类软体进行酶解、分离，鉴定出了许多作用独特、结构新颖的天然活性物质，其中以多糖及其复合物、牛磺酸、活性肽等为主，具有很高的医药价值。河蚬作为双壳贝类，资源极为丰富，食用价值很高，具有广泛的研究前景。
自由基（Free radical）是机体氧化反应中产生的有害化合物 ，具有强氧化性。自由基（尤其是羟自由基）的持续产生与积累，能够对人体细胞产生攻击，造成人体的衰老与疾病。
人类在进化过程中已产生对抗自由基的抗氧化系统，如抗氧化酶体系（超氧化物岐化酶、过氧化氢酶、谷胱甘肽过氧化物酶等）。这些抗氧化酶系和抗氧化剂组成了人体的防线，可以有效防止有害自由基（如羟自由基、DPPH自由基）对机体的伤害，保持人体在自由基的产生和清除上的平衡。不平衡出现而人体自身又无法调节时，适当补充一些抗氧化剂可以帮助机体维持平衡，进而预防疾病的发生[5]。
生物活性肽(Bioactive peptide)是一类是源于蛋白质分解得来的多功能化合物，具有促进免疫、激素调节、抗菌、抗病毒、降血压、降血脂等作用。按其来源可分为天然存在的活性肽和通过蛋白制备的活性肽。存在于细菌、真菌、动植物等生物体内的激素、酶抑制剂等天然活性肽，能够经分离提取获得，但天然活性肽含量甚微，提取困难，难以实现产业化。化学合成肽类的技术要求高，提取成本昂贵，很难实现工业化并为市场接受。目前，食品行业由于利益驱使，普遍使用化学合成的抗氧化剂，其本身具有毒副作用，因此，天然抗氧化剂的研究受到越来越多的关注。世界各国科学家开发出的各种天然抗氧化剂产品，受到了人们的广泛欢迎。特别是利用生物酶技术水解鱼类、贝类可将原来在肉中呈惰性的生物活性肽释放出来，由于水产品酶解液表现出抗氧化、抗菌、抗肿瘤等活性[6-7]，通过酶解水产动物蛋白是制备生物活性肽的主要方法之一。
河蚬肉蛋白酶解物中含有大量短肽、多肽及氨基酸等营养成分，并产生了一些具有特殊生理功能的生物活性肽，具有广泛应用前景。河蚬水解蛋白具有抗氧化活性也已经通过实验得到证实，河蚬抗氧化肽的分离提纯及活性的研究受到越来越多的关注。刘杰、万细妹等探讨河蚬蛋白酶解液在体外的抗氧化特性，并得出结论：河蚬酶解液具有显著的清除02-·和·OH作用，且活性与剂量呈量效关系，并对亚油酸脂质过氧化也显示出较强的抑制作用[8]。
本实验意在通过对河蚬肉酶解液中抗氧化肽进行分离，通过实验验证其抗氧化活性，并通过电泳分析酶解液中抗氧化肽的相对分子量，提高河蚬深加工产品的品质和附加值，为河蚬天然抗氧化肽的开发提供了理论及实验依据。
2材料与方法
2.1 实验材料
2.1.1 主要实验材料
冷冻河蚬肉 （江苏省宿迁楠景水产品有限公司）
中性蛋白酶 （ 蛋白酶活力不小于60000活力单位/g）
葡萄糖凝胶G-50 （上海蓝季科技发展有限公司）
低分子量标准蛋白Marker (上海近岸蛋白科技有限公司）
2.1.2 试剂及药品
氢氧化钠、盐酸、DPPH、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、氢氧化钠、三氯乙酸、三氯化铁、硫酸亚铁、铁氰化钾、乙醇、乙酸、过氧化氢、邻氮二菲，30%的丙烯酰胺、1.5M Tris(pH8.8)、1.0M Tris（pH6.8)、10%SDS、10%过硫酸铵、甲醇、冰醋酸，以上试剂均为分析纯，TEMED、溴酚蓝、考马斯亮蓝G250。
2.2 主要仪器设备
电子天平 （EL104 梅特勒—托利多仪器有限公司）
超低温冰箱 (BCD-216TDXZA 青岛海尔股份有限公司）
玻璃层析柱（Φ5.0×100cm) （江阴市新辉有限公司）
BSZ-30 自动部分收集器 （上海沪西分析仪器厂）
高速组织捣碎机 （上海比朗仪器制造有限公司）
数显恒温水浴锅HH-4 （国华电器有限公司）
pHS-2F型数字pH计 （上海精密科学仪器有限公司）
DHL-B 电脑数显定式恒流泵 (上海沪西分析仪器厂)
ALPHA1-4冷冻干燥机 （德国 MARTIN CHRIST公司）
TGL-20M高速台式冷冻离心机 （长沙湘仪离心机仪器有限公司）
UV-754紫外分光光度计 （上海精密科学仪器有限公司）
EPS-600 稳压稳流电泳仪 （上海伊瑞生物科技仪器有限公司）
小型垂直式电泳附件 （上海达平仪器有限公司）
3 实验方法
3.1 河蚬肉酶解液的制备
工艺流程: 新鲜河蚬肉→流水解冻→匀浆→调节pH→加入中性蛋白酶→酶解→灭酶→ 冷却→4000r/min离心20min→上清液→滤膜超滤→滤过液（河蚬肉酶解液）→冷冻干燥→河蚬肉干燥粉末
摘要
目的：分离河蚬肉酶解液中的抗氧化肽，对分离的各组分进行抗氧化性能测定，并分析各组分的分子量。方法：河蚬肉酶解后利用葡萄糖凝胶G-50进行分离纯化，并通过分光光度法对分离得到的抗氧化肽进行总抗氧化性、羟自由基清除能力、DPPH自由基清除能力进行测定。通过SDS-PAGE电泳技术分析各组分的分子量。结果：实验共分离出五种抗氧化肽，分别为F1、F2、F3、F4、F5。其中，F2的总抗氧化能力最强。组分F1、F3清除羟自由基能力较强分别为91.67%、83.33%，组分F2、F3清除DPPH自由基的能力较强分别为27.15%、26.35%。电泳得到组分S1、S2、S3、S4的分子量分别为86.9kD、65.7kD、18.9kD、3.6kD。结论：河蚬酶解液抗氧化肽的羟自由基清除能力突出，为河蚬抗氧化肽的进一步研究提供理论基础。
*查看完整论文请 +Q: 3 5 1 9 1 6 0 7 2
关键字:河蚬葡萄糖凝胶G-50抗氧化肽自由基清除率电泳分子量
目 录
1 引言 1
2 材料与方法 3
2.1 实验材料 3
2.1.1 主要实验材料 3
2.1.2 试剂及药品 3
2.2 主要仪器设备 3
3 实验方法 4
3.1 河蚬肉酶解液的制备 4
3.1.1 操作要点 4
3.2 河蚬肉酶解液中抗氧化肽的分离纯化 4
3.3 各组分抗氧化性的测定 4
3.3.1 总抗氧化性的测定（三价铁离子还原力） 4
3.3.2 羟自由基的清除率的测定 5
3.3.3 DPPH自由基清除能力测定 5
3.4抗氧化肽的电泳分离 6
4 结果与分析 8
4.1 葡萄糖凝胶G-50分离河蚬肉酶解液 8
4.2 河蚬肉酶解液中抗氧化肽的抗氧化特性研究 9
4.2.1 总抗氧化活性测定 9
4.2.2 羟自由基清除能力的测定 10
4.2.3 清除DPPH自由基能力的测定 11
4.3 河蚬肉酶解液中抗氧化肽的电泳 12
5 结论 14
参考文献 15
致 谢 16
1 引言
河蚬（Corbicula fluminea）是水生双壳类软体动物，生长在淡水或咸淡水的江河、湖泊及入海口，原产于我国，目前在世界各地水域均有广泛分布，它们生长速度快、繁殖能力强，养殖方法简单，资源极为丰富[1]。
河蚬味道鲜美，营养丰富，具有很高的食用价值和保健作用[2]。河蚬肉营养丰富，富含氨基酸、无机盐、不饱和脂肪酸、EPA和DHA。韩鹏[3]等对河蚬软体部分的营养成分进行了分析，结果表明：干样中, 粗蛋白含量为63.33%、粗脂肪含量为10.91%、灰分含量为6.29%，富含17种氨基酸，其中必需氨基酸占氨基酸总量的39.10%，并含有大量钙、钠、钾、镁、铁、锌、铜、锰等无机元素，与其他贝类相比，河蚬的蛋白质、多糖、脂肪含量均高于文蛤、贻贝、扇贝等。庄平[4]等通过对河蚬的营养成分进行分析，发现河蚬肉中还富含磷、铬、硒等矿物质。
近年来，国内外对双壳贝类软体进行酶解、分离，鉴定出了许多作用独特、结构新颖的天然活性物质，其中以多糖及其复合物、牛磺酸、活性肽等为主，具有很高的医药价值。河蚬作为双壳贝类，资源极为丰富，食用价值很高，具有广泛的研究前景。
自由基（Free radical）是机体氧化反应
人类在进化过程中已产生对抗自由基的抗氧化系统，如抗氧化酶体系（超氧化物岐化酶、过氧化氢酶、谷胱甘肽过氧化物酶等）。这些抗氧化酶系和抗氧化剂组成了人体的防线，可以有效防止有害自由基（如羟自由基、DPPH自由基）对机体的伤害，保持人体在自由基的产生和清除上的平衡。不平衡出现而人体自身又无法调节时，适当补充一些抗氧化剂可以帮助机体维持平衡，进而预防疾病的发生[5]。
生物活性肽(Bioactive peptide)是一类是源于蛋白质分解得来的多功能化合物，具有促进免疫、激素调节、抗菌、抗病毒、降血压、降血脂等作用。按其来源可分为天然存在的活性肽和通过蛋白制备的活性肽。存在于细菌、真菌、动植物等生物体内的激素、酶抑制剂等天然活性肽，能够经分离提取获得，但天然活性肽含量甚微，提取困难，难以实现产业化。化学合成肽类的技术要求高，提取成本昂贵，很难实现工业化并为市场接受。目前，食品行业由于利益驱使，普遍使用化学合成的抗氧化剂，其本身具有毒副作用，因此，天然抗氧化剂的研究受到越来越多的关注。世界各国科学家开发出的各种天然抗氧化剂产品，受到了人们的广泛欢迎。特别是利用生物酶技术水解鱼类、贝类可将原来在肉中呈惰性的生物活性肽释放出来，由于水产品酶解液表现出抗氧化、抗菌、抗肿瘤等活性[6-7]，通过酶解水产动物蛋白是制备生物活性肽的主要方法之一。
河蚬肉蛋白酶解物中含有大量短肽、多肽及氨基酸等营养成分，并产生了一些具有特殊生理功能的生物活性肽，具有广泛应用前景。河蚬水解蛋白具有抗氧化活性也已经通过实验得到证实，河蚬抗氧化肽的分离提纯及活性的研究受到越来越多的关注。刘杰、万细妹等探讨河蚬蛋白酶解液在体外的抗氧化特性，并得出结论：河蚬酶解液具有显著的清除02-·和·OH作用，且活性与剂量呈量效关系，并对亚油酸脂质过氧化也显示出较强的抑制作用[8]。
本实验意在通过对河蚬肉酶解液中抗氧化肽进行分离，通过实验验证其抗氧化活性，并通过电泳分析酶解液中抗氧化肽的相对分子量，提高河蚬深加工产品的品质和附加值，为河蚬天然抗氧化肽的开发提供了理论及实验依据。
2材料与方法
2.1 实验材料
2.1.1 主要实验材料
冷冻河蚬肉 （江苏省宿迁楠景水产品有限公司）
中性蛋白酶 （ 蛋白酶活力不小于60000活力单位/g）
葡萄糖凝胶G-50 （上海蓝季科技发展有限公司）
低分子量标准蛋白Marker (上海近岸蛋白科技有限公司）
2.1.2 试剂及药品
氢氧化钠、盐酸、DPPH、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、氢氧化钠、三氯乙酸、三氯化铁、硫酸亚铁、铁氰化钾、乙醇、乙酸、过氧化氢、邻氮二菲，30%的丙烯酰胺、1.5M Tris(pH8.8)、1.0M Tris（pH6.8)、10%SDS、10%过硫酸铵、甲醇、冰醋酸，以上试剂均为分析纯，TEMED、溴酚蓝、考马斯亮蓝G250。
2.2 主要仪器设备
电子天平 （EL104 梅特勒—托利多仪器有限公司）
超低温冰箱 (BCD-216TDXZA 青岛海尔股份有限公司）
玻璃层析柱（Φ5.0×100cm) （江阴市新辉有限公司）
BSZ-30 自动部分收集器 （上海沪西分析仪器厂）
高速组织捣碎机 （上海比朗仪器制造有限公司）
数显恒温水浴锅HH-4 （国华电器有限公司）
pHS-2F型数字pH计 （上海精密科学仪器有限公司）
DHL-B 电脑数显定式恒流泵 (上海沪西分析仪器厂)
ALPHA1-4冷冻干燥机 （德国 MARTIN CHRIST公司）
TGL-20M高速台式冷冻离心机 （长沙湘仪离心机仪器有限公司）
UV-754紫外分光光度计 （上海精密科学仪器有限公司）
EPS-600 稳压稳流电泳仪 （上海伊瑞生物科技仪器有限公司）
小型垂直式电泳附件 （上海达平仪器有限公司）
3 实验方法
3.1 河蚬肉酶解液的制备
工艺流程: 新鲜河蚬肉→流水解冻→匀浆→调节pH→加入中性蛋白酶→酶解→灭酶→ 冷却→4000r/min离心20min→上清液→滤膜超滤→滤过液（河蚬肉酶解液）→冷冻干燥→河蚬肉干燥粉末
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