黑茶冠突散囊菌液态发酵特性的研究
摘要：从江苏黑茶中分离提纯出冠突散囊菌菌株并研究其液态发酵特性。探讨了冠突散囊菌液体发酵培养条件，并将纯培养冠突散囊菌菌悬液接种于普通黄山毛峰茶，应用人工接种发酵技术进行固体发酵制成发酵茶。结果表明:冠突散囊菌发酵一个月后的黄山毛峰茶不仅品质成分明显改善，茶黄素和茶红素高于其他样品，而且苦涩味减轻; 使用纯菌液接种发酵筱砖茶可明显提高“金花”产量，可为改良传统工艺提供科学依据。
目录
摘要3
关键词3
Abstract3
Key words3
引言3
1材料与仪器4
1.1 材料 4
1.1.1 原料4
1.1.2 试剂4
1.1.3 培养基4
1.2 仪器设备 4
2 方法4
2.1.1 培养基配置4
2.1.2 接种培养4
2.2 冠突散囊菌液体发酵5
2.3 茶叶发酵4
2.3.1 微生物固体工艺发酵试验5
2.3.2 成品发酵茶感官评定5
3 结果与讨论5
3.1 黑茶用量对冠突散囊菌生长的影响5
3.2 冠突散囊菌分离纯化6
3.3 冠突散囊菌液体形态观察6
3.3 冠突散囊菌液体发酵7
3.4 菌落特征变化8
3.5 雨花茶、龙井茶中、黄山毛峰发酵试验8
3.6 试验不足与原因分析9
3.7 黑茶冠突散囊军与黑茶品质形成的关系10
致谢10
参考文献11
黑茶冠突散囊菌液态发酵特性的研究
引言
引言：黑茶属于后发酵茶，是我国特有的一大茶类，其生产历史悠久、产区广阔、销售量大、花色品种多。黑茶加工过程中渥堆处理被认为是发展形成黑茶特有品质的关键工序，虽然不同花色品种所采用的渥堆技术条件不尽相同，但目的都是促使粗老的鲜叶原料通过一定程度的发酵，形成叶色黑润、味醇和、香气纯正、汤色黄红明亮的品质特征，实际上就是在微生物的作用下使以茶多酚为主的化学成分发生一系列的化学变化[1, 2]。通过对黑茶发酵环境微生物群落
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: %3^5`1^9`1^6^0`7^2#
的种群结构和多样性进行深入探查并研究其动态变化，可以为优化黑茶发酵群落结构、调节群落功能和发现新的重要微生物功能类群提供可靠的依据。研究黑茶的微生物作用, 并对优势菌进行分离鉴定和有效利用, 对于黑茶优异品质的形成和渥堆工序的革新具有重要意义。
黑茶发酵过程中微生物群落对黑茶品质和风味的形成发挥了重要的作用，是黑茶特有品质形成的关键。加强黑茶后发酵过程中微生物群落结构和多样性的系统研究，阐明微生物在黑茶生产中的作用及其机理，开发黑茶，是实现黑茶的规范化生产，构建群体品牌，形成黑茶特色产业，并促进可持续发展的关键所在。
冠突散囊菌(Eurotium cristatum)属灰绿曲霉属，是黑茶发酵过程中的优势菌种，对黑茶独特品质的形成具有极其重要的作用。目前对冠突散囊菌的研究主要集中在菌种鉴定、固态培养的生理特征以及在伏砖茶生产中的应用等方面[3~ 7]。关于冠突散囊菌的生理功能特性、与黑茶品质形成的关系及其机理的研究却鲜见报道。为全面了解冠突散囊菌的生长特点与功能特性及其开发利用，为研究获黑茶特风味的形成机理提供理论依据，将现代发酵工程技术应用于黑茶生产，本研究从江苏黑茶中分离冠突散囊菌并研究其液态发酵的营养特性并优化发酵条件。
1 材料与仪器
1.1 材料
1.1.1 原料 江苏黑茶
1．1．2 试剂 蔗糖 硝酸钠 硫酸亚铁 磷酸氢二甲 KCL硫酸镁 琼脂
1．1．3 培养基 查氏培养基 硝酸钠 2g 硫酸亚铁0.01g 磷酸氢二甲 1g
蔗糖 30g KCL 0.5g 琼脂 15~20g 硫酸镁 0.5g 水 1000ml PH 自然 121℃/30min，灭菌。
马铃薯培养基 马铃薯 200g 琼脂 15~20g 蔗糖20g 水 1000ml PH 自然 121℃/30min，灭菌。
1．2 仪器设备
SWCJIBU超净工作台 苏净集团安泰公司制造；
MJX160BZ恒温培养箱 上海博讯实业有限公司医疗设备厂；
LDZX50KBS立体式压力蒸汽灭菌器 上海申安有限公司
2 方法
2.1 冠突散囊菌分离纯化与形态观察
2.1.1 培养基配制
含适量茶汤的查氏培养基、含适量茶汤的马铃薯葡萄糖琼脂培养基、普通查氏培养基（CZ）、普通马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA）
2.1.2 接种培养
在浓度为0.2%.0.4%, 0. 6%, 0.8%, 1.0%,1. 2%的黑茶汁中，分别添加6%的蔗糖，比较黑茶用量对冠突散囊菌生长的影响。
在无菌环境下将适量江苏省黑茶撒在含适量茶汤的查氏培养基和含适量茶汤的马铃薯葡萄糖琼脂培养基上，放入28℃培养箱中培养观察。在使用原培养基进行多次转接后，可使用普通CZ和PDA进行培养，待其纯化后再接入普通CZ斜面和PDA斜面，长成菌落后保存于4℃冰箱中备用。
直接用无菌拔针挑取江苏黑茶上的黄色闭囊壳并接种于PDA琼脂平板培养基上，30℃培养，待菌落在平板上生长进人旺盛期时，用无菌接种环挑取少量黄色闭囊壳进行平板划线，经23次平板划线后该菌已初步纯化。从培养96h的划线平板上选取单菌落，移植于空白PDA平板上，继续培养。待该菌落生长处于旺盛期时，用接种环挑取适量黄色闭囊壳放人盛有100 mL无菌水并带有玻璃珠的三角瓶内，振摇10 min，制成均匀抱子液，然后进行10倍等递增稀释，获得102~105稀释度的抱子悬液。用无菌吸管分别吸取1mL各稀释度的抱子悬液注人无菌培养皿中，再倾注适量40℃左右的PDA培养基，摇匀，静置，凝固，30℃倒置培养。选取仅长有2个单菌落的平板，该平板上的单菌落即纯培养，观察菌落特征并结合显微镜检测个体形态特征[8]。
2.2 冠突散囊菌液体发酵
查阅文献可知冠突散囊菌生长对营养条件要求不太苛刻，能耐受一定渗透压，适应能力较强。
冠突散囊菌液态培养基的最佳组成为:黑茶浸提液0.8%、蔗糖6%。最优发酵条件为:初始pH值5.5，温度30℃，接种量1.5%(抱子浓度为5.06.0*108个/mL)，摇瓶转数120r/min。[9]活化纯化完成的冠突散囊菌，转接于加入玻璃珠的PDA液体培养基中，30℃摇瓶培养。
2.3 茶叶发酵
待液体发酵完成后，对原料茶进行发酵试验。对发酵完成原料茶的外形、汤色、香气和滋味等进行感官评审，同时对其常规成分如茶多酚含量、水浸出物总量、氨基酸含量等进行测定。
2.3．1 微生物固体工艺发酵试验
用分离提纯出的冠突散囊菌稀释液直接洒于原料茶，对其进行发酵；吸取普通发酵液2ml加入2g雨花茶、龙井茶中，发酵6d。吸取加玻璃珠后发酵液2ml加入2g雨花茶、龙井茶和黄山毛峰中，发酵6d。
目录
摘要3
关键词3
Abstract3
Key words3
引言3
1材料与仪器4
1.1 材料 4
1.1.1 原料4
1.1.2 试剂4
1.1.3 培养基4
1.2 仪器设备 4
2 方法4
2.1.1 培养基配置4
2.1.2 接种培养4
2.2 冠突散囊菌液体发酵5
2.3 茶叶发酵4
2.3.1 微生物固体工艺发酵试验5
2.3.2 成品发酵茶感官评定5
3 结果与讨论5
3.1 黑茶用量对冠突散囊菌生长的影响5
3.2 冠突散囊菌分离纯化6
3.3 冠突散囊菌液体形态观察6
3.3 冠突散囊菌液体发酵7
3.4 菌落特征变化8
3.5 雨花茶、龙井茶中、黄山毛峰发酵试验8
3.6 试验不足与原因分析9
3.7 黑茶冠突散囊军与黑茶品质形成的关系10
致谢10
参考文献11
黑茶冠突散囊菌液态发酵特性的研究
引言
引言：黑茶属于后发酵茶，是我国特有的一大茶类，其生产历史悠久、产区广阔、销售量大、花色品种多。黑茶加工过程中渥堆处理被认为是发展形成黑茶特有品质的关键工序，虽然不同花色品种所采用的渥堆技术条件不尽相同，但目的都是促使粗老的鲜叶原料通过一定程度的发酵，形成叶色黑润、味醇和、香气纯正、汤色黄红明亮的品质特征，实际上就是在微生物的作用下使以茶多酚为主的化学成分发生一系列的化学变化[1, 2]。通过对黑茶发酵环境微生物群落
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的种群结构和多样性进行深入探查并研究其动态变化，可以为优化黑茶发酵群落结构、调节群落功能和发现新的重要微生物功能类群提供可靠的依据。研究黑茶的微生物作用, 并对优势菌进行分离鉴定和有效利用, 对于黑茶优异品质的形成和渥堆工序的革新具有重要意义。
黑茶发酵过程中微生物群落对黑茶品质和风味的形成发挥了重要的作用，是黑茶特有品质形成的关键。加强黑茶后发酵过程中微生物群落结构和多样性的系统研究，阐明微生物在黑茶生产中的作用及其机理，开发黑茶，是实现黑茶的规范化生产，构建群体品牌，形成黑茶特色产业，并促进可持续发展的关键所在。
冠突散囊菌(Eurotium cristatum)属灰绿曲霉属，是黑茶发酵过程中的优势菌种，对黑茶独特品质的形成具有极其重要的作用。目前对冠突散囊菌的研究主要集中在菌种鉴定、固态培养的生理特征以及在伏砖茶生产中的应用等方面[3~ 7]。关于冠突散囊菌的生理功能特性、与黑茶品质形成的关系及其机理的研究却鲜见报道。为全面了解冠突散囊菌的生长特点与功能特性及其开发利用，为研究获黑茶特风味的形成机理提供理论依据，将现代发酵工程技术应用于黑茶生产，本研究从江苏黑茶中分离冠突散囊菌并研究其液态发酵的营养特性并优化发酵条件。
1 材料与仪器
1.1 材料
1.1.1 原料 江苏黑茶
1．1．2 试剂 蔗糖 硝酸钠 硫酸亚铁 磷酸氢二甲 KCL硫酸镁 琼脂
1．1．3 培养基 查氏培养基 硝酸钠 2g 硫酸亚铁0.01g 磷酸氢二甲 1g
蔗糖 30g KCL 0.5g 琼脂 15~20g 硫酸镁 0.5g 水 1000ml PH 自然 121℃/30min，灭菌。
马铃薯培养基 马铃薯 200g 琼脂 15~20g 蔗糖20g 水 1000ml PH 自然 121℃/30min，灭菌。
1．2 仪器设备
SWCJIBU超净工作台 苏净集团安泰公司制造；
MJX160BZ恒温培养箱 上海博讯实业有限公司医疗设备厂；
LDZX50KBS立体式压力蒸汽灭菌器 上海申安有限公司
2 方法
2.1 冠突散囊菌分离纯化与形态观察
2.1.1 培养基配制
含适量茶汤的查氏培养基、含适量茶汤的马铃薯葡萄糖琼脂培养基、普通查氏培养基（CZ）、普通马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA）
2.1.2 接种培养
在浓度为0.2%.0.4%, 0. 6%, 0.8%, 1.0%,1. 2%的黑茶汁中，分别添加6%的蔗糖，比较黑茶用量对冠突散囊菌生长的影响。
在无菌环境下将适量江苏省黑茶撒在含适量茶汤的查氏培养基和含适量茶汤的马铃薯葡萄糖琼脂培养基上，放入28℃培养箱中培养观察。在使用原培养基进行多次转接后，可使用普通CZ和PDA进行培养，待其纯化后再接入普通CZ斜面和PDA斜面，长成菌落后保存于4℃冰箱中备用。
直接用无菌拔针挑取江苏黑茶上的黄色闭囊壳并接种于PDA琼脂平板培养基上，30℃培养，待菌落在平板上生长进人旺盛期时，用无菌接种环挑取少量黄色闭囊壳进行平板划线，经23次平板划线后该菌已初步纯化。从培养96h的划线平板上选取单菌落，移植于空白PDA平板上，继续培养。待该菌落生长处于旺盛期时，用接种环挑取适量黄色闭囊壳放人盛有100 mL无菌水并带有玻璃珠的三角瓶内，振摇10 min，制成均匀抱子液，然后进行10倍等递增稀释，获得102~105稀释度的抱子悬液。用无菌吸管分别吸取1mL各稀释度的抱子悬液注人无菌培养皿中，再倾注适量40℃左右的PDA培养基，摇匀，静置，凝固，30℃倒置培养。选取仅长有2个单菌落的平板，该平板上的单菌落即纯培养，观察菌落特征并结合显微镜检测个体形态特征[8]。
2.2 冠突散囊菌液体发酵
查阅文献可知冠突散囊菌生长对营养条件要求不太苛刻，能耐受一定渗透压，适应能力较强。
冠突散囊菌液态培养基的最佳组成为:黑茶浸提液0.8%、蔗糖6%。最优发酵条件为:初始pH值5.5，温度30℃，接种量1.5%(抱子浓度为5.06.0*108个/mL)，摇瓶转数120r/min。[9]活化纯化完成的冠突散囊菌，转接于加入玻璃珠的PDA液体培养基中，30℃摇瓶培养。
2.3 茶叶发酵
待液体发酵完成后，对原料茶进行发酵试验。对发酵完成原料茶的外形、汤色、香气和滋味等进行感官评审，同时对其常规成分如茶多酚含量、水浸出物总量、氨基酸含量等进行测定。
2.3．1 微生物固体工艺发酵试验
用分离提纯出的冠突散囊菌稀释液直接洒于原料茶，对其进行发酵；吸取普通发酵液2ml加入2g雨花茶、龙井茶中，发酵6d。吸取加玻璃珠后发酵液2ml加入2g雨花茶、龙井茶和黄山毛峰中，发酵6d。
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