鸟贝多糖结构及活性测试
目 录
1 引言 1
1.1 鸟贝 1
1.2 多糖的结构和抗氧化活性 2
1.3 研究过程中的注意点 3
1.4 课题研究的背景及意义 3
2 实验材料与方法 4
2.1 实验材料 4
2.2 主要仪器设备与试剂 4
3 试验方法 4
3.1 操作流程 4
3.2 鸟贝粗多糖提取工艺 4
3.3 鸟贝多糖DEAE-纤维素柱层析 5
3.4 鸟贝多糖的一般性质和结构 7
3.5 鸟贝多糖抗氧化活性的测定 8
结 论 14
致 谢 15
参 考 文 献 16
1 引言
随着生物多糖方面研究的日益增长，很多生物资源得到有效的开发和利用。在众多生物种类中，贝类多糖的研究也蓬勃兴起，现已发现其具有独特的结构，拥有多种生物活性，以增强免疫体制功能最为突出。针对这一特性，给新药物的开发创造了良好的条件[1]。
本实验以鸟贝粗多糖为实验材料，采用离子交换层析法对鸟贝粗多糖进行分离纯化。通过测定鸟贝多糖纯化组分的紫外和红外吸收特性，以及液相色谱法图谱的初步鉴定，了解其多糖结构的特殊性。
分别对粗多糖及其纯化样品进行抗氧化活性指标的测定，检测还原力、金属离子螯合能力、羟自由基清除能力等，最后对鸟贝多糖及纯化组分的抗氧化活性进行评价。
1.1 鸟贝
1.1.1 鸟贝简介
鸟贝也叫石垣贝，因其形状像鸟头而得名，学名鸟蛤，属维纳斯贝目。
鸟贝是一种海洋贝类生物，通常生活在海滩边的泥沙下。鲜活鸟贝的外观艳丽，椭圆形的 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ￥351916072￥
壳点缀有被凹槽分开的平滑的螺旋状罗纹。铰链骨板很小并且弯曲得很厉害。左瓣的铰链中央有两颗很小的扩散状齿，并与右瓣的一个窄小的齿相吻合。铰链前端延伸成1或2颗侧齿。另一侧有微升起的骨板，与其相连接的是韧带，两瓣的内缘有突出的槽。
1.1.2 鸟贝的营养价值
鸟贝，以体大、壳薄艳丽、肉脆嫩、味甘美而闻名。鸟贝不仅肉质细嫩，味美可口，还对人体有良好的保健功效。
它可以作为补充优质蛋白质和钙元素的首选原料，且鸟贝肉含有多种氨基酸，具有清热解毒、滋阴平肝、明目防眼疾等作用，适宜阴虚内热之人食用。
1.2 多糖的结构和抗氧化活性
1.2.1 多糖的结构测定
研究多糖结构，需要了解其糖残基的种类、分子量和联接类型等众多问题。其中，一级结构的分析尤为关键，分析涉及的方法一般包括红外光谱、紫外-可见光谱、高效液相色谱、甲基化反应、酸水解和核磁共振等方法。
当中化学研究方法主要是下面介绍的这几种：
高碘酸的氧化：高碘酸能够自主性地去选择是裂开糖分子中的连三羟基，还是连二羟基，并产生对应的甲酸、多糖醛或者是甲醛。反应是恒量进行的，裂开一个C- C这种键型就会耗掉一分子的高碘酸。经过测出甲酸的释放值以及高碘酸的耗费值，能够判定出糖苷键的比例与键型。
酸水解：酸水解能够鉴定不同的单糖组成。
甲基化反应：甲基化反应基本上都是把糖全部的自由羟基都经反应生成了甲醚，接着甲基化单糖释放这一步是经过水解来完成的，进而通过NaBH4使它还原成糖醇，再经乙酰化水解产生羟基，最后变成甲基化了的糖醇乙酰衍生物，通过HPLC或是GC进行分析，来测定糖链中的不同单糖组份的比例与种类，不同单糖的相应位置，也就是糖苷键的位置[2]。
Smith降解：Smith降解即把经高碘酸氧化过的生成物还原成性质稳定的多羟基化合物之后，进行一部分酸水解，经过HPLC或者GC鉴别水解的产物，通过水解产物来判定单糖在多糖当中的键型与连接的次序。
1.2.2 多糖结构采用的仪器方法
通过对红外光谱中测定的多糖特征吸收峰进行分析，确定单糖的种类，通过谱图对糖苷键上取代基进行鉴定[3]。
通过高效液相色谱法，能有效对多糖的分子量进行测定和分析。
1.2.3 多糖抗氧化活性的描述
1.2.3.1 多糖的抗氧化活性
目前测定抗氧化活性的方法有很多，例如测定样品对检测体系中自由基的清除如羟自由基、DPPH、超氧阴离子自由基等，检测样品的还原能力反应样品的抗氧化活性。
1.2.3.2 多糖抗氧化活性应用
多糖的抗氧化活性在医学中的应用最为广泛，有利于身体机理的调节，促进新陈代谢推迟皮肤衰老，对人体内脏的修复和治疗效果也相当显著。
1.2.3.3 多糖的抗肿瘤活性
鸟贝多糖对人体中的肝癌细胞有显著的抑制功能。鸟贝多糖同环磷酰胺的混用可以增加化疗药物环磷酰胺使动物体脾指数所发生的概率降低，提高了抗肿瘤功效，而且增加了抑制肿瘤几率，进而减少了环磷酰胺的毒性作用[4]。
1.3 研究过程中的注意点
在利用DEAE-纤维素分离纯化鸟贝粗多糖时，由于其中混有的少量纤维素，这将导致分离效果变差，为了去除该影响， *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ￥351916072￥
所以须用酸碱溶液交替洗涤，将上层的浑浊液去除掉，再将其存至NaOH（0.5 mol/L）溶液中备用，所采用的酸液为HCl（0.5 mol/L）、NaOH（0.5 mol/L）。
对透析袋的前处理也至关重要：首先将它剪成15 cm左右的小片段，然后再在500 ml的2%的碳酸氢钠溶液中煮沸10 min左右，紧接着是在1 mol/L EDTA中将它煮沸10 min左右，最后再用蒸馏洗3次，才能使用。实验过程中，应严格按照实验安全规程操作，注意个人安全及实验室安全。
1.4 课题研究的背景及意义
当前，各国相关研究人员从各类动植物体内提取出许多有活性的多糖，这些多糖在抗肿瘤，免疫调节，抗氧化，降血糖和抗病毒这些方面表现了很好的应用前景，是相对理想的保健食品和新药基础材料。
随着发现更多具备着各种不同生物活性的多糖，使之在医学临床方面得到广泛而有效的应用。无论是国内还是国外在多糖结构探究这一方面都是这两种走向：第一种是建立于多糖的一般结构研究手段的前提下，引进了PCR和免疫生物化学某些现代的分子生物学技术，对多糖的活性和化学结构展开系统的探究；第二种是在最新的计算机模拟技术和仪器的作用之下，模拟与探究植物多糖在液体中的结构变化现象，来探究当这种物质参加到生物的生命活动中并生成生物效应时的细微结构特征。
多糖是一类具有广泛生物活性的生物大分子，具有抗病毒、抗肿瘤、延缓衰老、降血压和增强免疫力等功能[5]。随着糖类生物学的建立,越来越多的生物活性被人所探知，糖类在生物学、医学领域发挥着越来越大的作用。但是海洋贝类中多糖的含量较低，分离提取的方法较多，但还没有找到较为好的方法，所以导致纯化多糖的提取比较困难，纯度也较低。
本实验通过DEAE-52纤维素色谱法试图找出多糖提取的某些问题，进一步改善提纯多糖。通过提取纯化鸟贝多糖，采用化学检测、仪器分析、生物活性评价等方法对鸟贝多糖结构特性、生物活性进行研究。该研究在丰富生物药物种类，深入药物功效机理研究，开发海洋药物资源，提高海洋贝类产品附加值以及推动海洋贝类养殖业发展等方面必将发挥积极作用。
1 引言 1
1.1 鸟贝 1
1.2 多糖的结构和抗氧化活性 2
1.3 研究过程中的注意点 3
1.4 课题研究的背景及意义 3
2 实验材料与方法 4
2.1 实验材料 4
2.2 主要仪器设备与试剂 4
3 试验方法 4
3.1 操作流程 4
3.2 鸟贝粗多糖提取工艺 4
3.3 鸟贝多糖DEAE-纤维素柱层析 5
3.4 鸟贝多糖的一般性质和结构 7
3.5 鸟贝多糖抗氧化活性的测定 8
结 论 14
致 谢 15
参 考 文 献 16
1 引言
随着生物多糖方面研究的日益增长，很多生物资源得到有效的开发和利用。在众多生物种类中，贝类多糖的研究也蓬勃兴起，现已发现其具有独特的结构，拥有多种生物活性，以增强免疫体制功能最为突出。针对这一特性，给新药物的开发创造了良好的条件[1]。
本实验以鸟贝粗多糖为实验材料，采用离子交换层析法对鸟贝粗多糖进行分离纯化。通过测定鸟贝多糖纯化组分的紫外和红外吸收特性，以及液相色谱法图谱的初步鉴定，了解其多糖结构的特殊性。
分别对粗多糖及其纯化样品进行抗氧化活性指标的测定，检测还原力、金属离子螯合能力、羟自由基清除能力等，最后对鸟贝多糖及纯化组分的抗氧化活性进行评价。
1.1 鸟贝
1.1.1 鸟贝简介
鸟贝也叫石垣贝，因其形状像鸟头而得名，学名鸟蛤，属维纳斯贝目。
鸟贝是一种海洋贝类生物，通常生活在海滩边的泥沙下。鲜活鸟贝的外观艳丽，椭圆形的 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ￥351916072￥
壳点缀有被凹槽分开的平滑的螺旋状罗纹。铰链骨板很小并且弯曲得很厉害。左瓣的铰链中央有两颗很小的扩散状齿，并与右瓣的一个窄小的齿相吻合。铰链前端延伸成1或2颗侧齿。另一侧有微升起的骨板，与其相连接的是韧带，两瓣的内缘有突出的槽。
1.1.2 鸟贝的营养价值
鸟贝，以体大、壳薄艳丽、肉脆嫩、味甘美而闻名。鸟贝不仅肉质细嫩，味美可口，还对人体有良好的保健功效。
它可以作为补充优质蛋白质和钙元素的首选原料，且鸟贝肉含有多种氨基酸，具有清热解毒、滋阴平肝、明目防眼疾等作用，适宜阴虚内热之人食用。
1.2 多糖的结构和抗氧化活性
1.2.1 多糖的结构测定
研究多糖结构，需要了解其糖残基的种类、分子量和联接类型等众多问题。其中，一级结构的分析尤为关键，分析涉及的方法一般包括红外光谱、紫外-可见光谱、高效液相色谱、甲基化反应、酸水解和核磁共振等方法。
当中化学研究方法主要是下面介绍的这几种：
高碘酸的氧化：高碘酸能够自主性地去选择是裂开糖分子中的连三羟基，还是连二羟基，并产生对应的甲酸、多糖醛或者是甲醛。反应是恒量进行的，裂开一个C- C这种键型就会耗掉一分子的高碘酸。经过测出甲酸的释放值以及高碘酸的耗费值，能够判定出糖苷键的比例与键型。
酸水解：酸水解能够鉴定不同的单糖组成。
甲基化反应：甲基化反应基本上都是把糖全部的自由羟基都经反应生成了甲醚，接着甲基化单糖释放这一步是经过水解来完成的，进而通过NaBH4使它还原成糖醇，再经乙酰化水解产生羟基，最后变成甲基化了的糖醇乙酰衍生物，通过HPLC或是GC进行分析，来测定糖链中的不同单糖组份的比例与种类，不同单糖的相应位置，也就是糖苷键的位置[2]。
Smith降解：Smith降解即把经高碘酸氧化过的生成物还原成性质稳定的多羟基化合物之后，进行一部分酸水解，经过HPLC或者GC鉴别水解的产物，通过水解产物来判定单糖在多糖当中的键型与连接的次序。
1.2.2 多糖结构采用的仪器方法
通过对红外光谱中测定的多糖特征吸收峰进行分析，确定单糖的种类，通过谱图对糖苷键上取代基进行鉴定[3]。
通过高效液相色谱法，能有效对多糖的分子量进行测定和分析。
1.2.3 多糖抗氧化活性的描述
1.2.3.1 多糖的抗氧化活性
目前测定抗氧化活性的方法有很多，例如测定样品对检测体系中自由基的清除如羟自由基、DPPH、超氧阴离子自由基等，检测样品的还原能力反应样品的抗氧化活性。
1.2.3.2 多糖抗氧化活性应用
多糖的抗氧化活性在医学中的应用最为广泛，有利于身体机理的调节，促进新陈代谢推迟皮肤衰老，对人体内脏的修复和治疗效果也相当显著。
1.2.3.3 多糖的抗肿瘤活性
鸟贝多糖对人体中的肝癌细胞有显著的抑制功能。鸟贝多糖同环磷酰胺的混用可以增加化疗药物环磷酰胺使动物体脾指数所发生的概率降低，提高了抗肿瘤功效，而且增加了抑制肿瘤几率，进而减少了环磷酰胺的毒性作用[4]。
1.3 研究过程中的注意点
在利用DEAE-纤维素分离纯化鸟贝粗多糖时，由于其中混有的少量纤维素，这将导致分离效果变差，为了去除该影响， *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ￥351916072￥
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对透析袋的前处理也至关重要：首先将它剪成15 cm左右的小片段，然后再在500 ml的2%的碳酸氢钠溶液中煮沸10 min左右，紧接着是在1 mol/L EDTA中将它煮沸10 min左右，最后再用蒸馏洗3次，才能使用。实验过程中，应严格按照实验安全规程操作，注意个人安全及实验室安全。
1.4 课题研究的背景及意义
当前，各国相关研究人员从各类动植物体内提取出许多有活性的多糖，这些多糖在抗肿瘤，免疫调节，抗氧化，降血糖和抗病毒这些方面表现了很好的应用前景，是相对理想的保健食品和新药基础材料。
随着发现更多具备着各种不同生物活性的多糖，使之在医学临床方面得到广泛而有效的应用。无论是国内还是国外在多糖结构探究这一方面都是这两种走向：第一种是建立于多糖的一般结构研究手段的前提下，引进了PCR和免疫生物化学某些现代的分子生物学技术，对多糖的活性和化学结构展开系统的探究；第二种是在最新的计算机模拟技术和仪器的作用之下，模拟与探究植物多糖在液体中的结构变化现象，来探究当这种物质参加到生物的生命活动中并生成生物效应时的细微结构特征。
多糖是一类具有广泛生物活性的生物大分子，具有抗病毒、抗肿瘤、延缓衰老、降血压和增强免疫力等功能[5]。随着糖类生物学的建立,越来越多的生物活性被人所探知，糖类在生物学、医学领域发挥着越来越大的作用。但是海洋贝类中多糖的含量较低，分离提取的方法较多，但还没有找到较为好的方法，所以导致纯化多糖的提取比较困难，纯度也较低。
本实验通过DEAE-52纤维素色谱法试图找出多糖提取的某些问题，进一步改善提纯多糖。通过提取纯化鸟贝多糖，采用化学检测、仪器分析、生物活性评价等方法对鸟贝多糖结构特性、生物活性进行研究。该研究在丰富生物药物种类，深入药物功效机理研究，开发海洋药物资源，提高海洋贝类产品附加值以及推动海洋贝类养殖业发展等方面必将发挥积极作用。
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