基于聚硫堇和多壁碳纳米管的一次性有机磷农药酶传感器的研制
基于聚硫堇和多壁碳纳米管的一次性有机磷农药酶传感器的研制[20200408174616]
摘要
有机磷农药是我国常用的农药之一，对粮食的丰产丰收起着重要作用，但由此导致的农产品中农药残留及环境污染问题日益受到人们的重视，为保障公众的健康，各个国家都制订了农产品和食品中农药残留的最大限量标准，并有相关检测方法标准，但已有的快速检测方法已无法满足大批量农产品和食品的现场快速检测需要。电化学分析具有快捷性，酶对底物的催化具有特异性，电化学酶生物传感器将两者结合起来，可实现对样品的快速、特异、灵敏的检测。聚硫堇和碳纳米管都具有良好的导电性能，在生物传感器方面具有较广泛的应用。本文将聚硫堇和碳纳米管用作电子介体修饰于一次性电极表面，用溶胶凝胶将乙酰胆碱酯酶（AChE）固定在一次性电极上，利用AChE对氯化硫代乙酰胆碱的催化引起电极电流响应的变化，制成了新型酶生物传感器。实验表明该传感器响应快、灵敏度高、稳定性好，酶传感器在农药辛硫磷浓度为0.01μg/ml~300μg/ml范围内，抑制率与有机磷农药辛硫磷的浓度的对数呈良好的线性关系，线性方程式为：抑制率%=42.63+14.92logC，相关系数R=0.9866，最低检出限为0.0065μg/ml，有望用于有机磷农药残留的快速检测。
*查看完整论文请 +Q: 3 5 1 9 1 6 0 7 2
关键字:有机磷农药生物传感器碳纳米管聚硫堇
目录
1．引言 1
1.1 果蔬中有机磷农药残留现状及危害 1
1.2有机磷农药的检测方法研究进展 1
1.2.1 气相色谱法(GC) 1
1.2.2 高效液相色谱法(HPLC) 1
1.2.3 薄层色谱法(TLC) 2
1.2.4 酶抑制法 2
1.2.5 免疫法 3
1.2.6 其他方法 3
1.3 酶传感器的概述 4
2．实验部分 6
2.1 实验设计与原理 6
2.2 试剂与仪器 6
2.3 实验方法 7
2.3.1 碳纳米管的预处理 7
2.3.2 酶电极的制备 7
2.3.3 测定方法 7
3.结果与讨论 8
3.1 酶电极的电化学表征 8
3.1.1不同修饰阶段电极的循环伏安特性 8
3.1.2酶电极对底物溶液的响应 8
3.2电极修饰条件的优化 10
3.2.1 乙酰胆碱酯酶用量的优化 10
3.2.2 碳纳米管用量的优化 10
3.3酶电极反应条件的优化 11
3.3.1温度的优化 11
3.3.2 底液pH的优化 12
3.3.3 抑制时间的选择 13
3.4 有机磷农药抑制率曲线的建立 13
3.5酶传感器的稳定性及样品回收率试验 14
3.5.1酶传感器的重现性和稳定性 14
3.5.2 酶电极对蔬菜样品的回收率试验 15
4.结论 16
参考文献 17
致谢 19
1．引言
1.1 果蔬中有机磷农药残留现状及危害
目前有机磷农药在我国广泛用于植物病虫害的防治，对保证粮食丰收起着重要作用，但由此带来的农药残留问题不断显现，从而对人体健康产生危害。2005—2007 年，济南市对4个大型农贸市场销售的卷心菜、小白菜、韭菜等蔬菜进行了采样并进行检测，有机磷类农药总检出率32.66%，超标率25.63%，其中甲胺磷农药最高检出量为114.013mg/kg，氧化乐果最高检出量达到11.807%[1]。
有机磷农药比有机氯农药相对容易降解，而且药效较高，成本低廉[2]。但有机磷农药达一定量也有着较高的毒性,一旦进入人体可以使中枢神经系统及胆碱能神经呈过度兴奋状态，从而出现了中毒症状，而小剂量的长期摄入也导致心脏、肝脏、生殖系统等的慢性损害。
1.2有机磷农药的检测方法研究进展
目前有机磷农药的主要分析方法以色谱法为主，其他还有酶抑制法、免疫法等多种方法来。
1.2.1 气相色谱法(GC)
气相色谱法(Gas chromatography)是根据分析物质在固定相和流动相之间的分配系数的不同达到分离目的，并将分析物质的浓度转换成易被测量的电信号，然后送到记录仪记录下来的一类分离分析方法。帕尔哈提[3]利用TRACE CC2000气相色谱仪和NPD检测器等，对甲胺磷、对硫磷等九种农药的残留量（蔬菜）进行了检测和分析，回收率达到了81.5%-104.4%，最低检测限也达到了0.005mg/L，显示了不错的效果。气相色谱分离效率高、选择性较强、灵敏度相对较高、分析速度快等显著的特点，目前已应用于众多领域。但所需仪器昂贵，设备笨重，只能用于实验室和研究机构的常规测定。
1.2.2 高效液相色谱法(HPLC)
高效液相色谱法(HPLC)应用范围很广，经过数十年的发展，逐渐得到完善。因其具有的应用颗粒细、固定相也非常规则均匀、分离效率又高等特点，在农药残留检测方面也极有应用性。包宏[4]等利用Waters HPLC等仪器对西红柿中的克线磷的残留量进行了检测，回收率达到了83.9%~91.4%，具有良好的效果。高效液相色谱法具有简单方便、灵敏度高、重现性好等优点，一直被广泛使用，但仪器昂贵，设备笨重，只能用于实验室和研究机构的常规测定。
1.2.3 薄层色谱法(TLC)
薄层色谱法(Thin-Layer Chromatography)是通过提高薄层板的有效板数来改变薄层板的分离能力的一种在传统的色谱法的基础上加以改进优化的色谱法。对仪器的要求不高，但检测时的灵敏度不高。樊玮[5]等利用CAMAG TLC Scanner薄层扫描仪，测定了茶叶中的农药（高效氯氟氰菊酯、联苯菊酯）残留，回收率达到了82.1%~105%和75.2%~98.6%，实验中的准确性和重现性等也达到了农残分析的基本要求。
1.2.4 酶抑制法
有机磷农药可以抑制胆碱酯酶的活性，酶抑制技术(Enzyme Inhibition)利用了这一原理来检测分析果蔬食品中农药残留量的技术。Akkad R［6］等测定有机磷农药时利用了该技术，各项指标基本达到了农药残留的要求。该法对仪器的要求不高，操作简单效率高效，但灵敏度不强，重复性、回收率还有待提高。
生物传感器就是利用了酶抑制技术的原理研究出来的，利用传感器输出的信号（电压、频率等）进行定性和定量的检测。干宁等[7]采用纳米修饰电极制成了生物传感器，通过乙酰胆碱反应时间-电流图，得出了一定的线性关系，再通过有机溶剂对酶的影响实验和酶电极对有机磷类农药进行检测，得出了不错的结果。还有陈向强等[8]也通过制备电极进行了电流电位等实验，应用到了农药检测的领域。
另外，吕延成等[9]对ph、缓冲液浓度等条件对乙酰胆碱酯酶的固定化条件进行了研究，对利用酶活性而制成的生物传感器研究提供了依据。
近来，由于碳纳米管的优良电催化性能，也被应用到了生物传感器的研制中。刘润等[10]用碳纳米管修饰电极制成的生物传感器对辛硫磷和氧化乐果的加标回收率分别为104.5%和97.5%，显示了良好的应用前景。
对于检测有机磷来说，生物传感器有着很大的优势，比如：较小的体积、低廉的成本、选择性及抗干扰能力强、响应快，多个样品也能同时被检测，还有着较高的灵敏度。近年来, 生物传感技术得到了更广泛的研究和应用。
1.2.5 免疫法
免疫法根据标记物的不同主要分为两种免疫分析技术，一种为RIA（放射免疫)，另一种为EIA（酶免疫分析)。其原理均为通过抗体与抗原之间有特异性结合对物质进行定量的分析。由于RIA在免疫分析时存在一些问题，比如：放射性保护和废物处理等，现在的农药分析主要以EIA为主。Liang[11]等人建立了一种广谱特异性的间接竞争ELSIA，能检测多种有机磷农药。对中国大白菜进行马拉硫磷、乐果、乙酰奋乃静的回收检测，回收率为77.11% -104.17%。
1.2.6 其他方法
近些年来发展起来了一些新型农药检测技术，太赫兹时域光谱技术就是其中一种。该技术有着样品制备简单、波能量低、信噪比高、检测速度快等特点。颜志刚［12］等通过研究乙酰甲胺磷的太赫兹光谱，实验结果较为理想，为食品中农药残留的检测提供了理论依据。
综述以上各种检测方法，气相色谱和高效液相色谱所需仪器昂贵，设备笨重，只能用于实验室和研究机构的常规测定。薄层色谱对仪器要求不高，实际操作也简便，但灵敏度不高。酶抑制技术所用仪器较为廉价，实际操作也便于学习和掌握，但在灵敏度、重复性、回收率方面还有发展的空间。免疫分析法所需的实验设备简单并且安全廉价，检验灵敏，实验过程也快速准确，但需要专业技术人员, 应用较少，不易推广。开发出简便、快捷、灵敏的检测技术，已成为当今研究的重点。
摘要
有机磷农药是我国常用的农药之一，对粮食的丰产丰收起着重要作用，但由此导致的农产品中农药残留及环境污染问题日益受到人们的重视，为保障公众的健康，各个国家都制订了农产品和食品中农药残留的最大限量标准，并有相关检测方法标准，但已有的快速检测方法已无法满足大批量农产品和食品的现场快速检测需要。电化学分析具有快捷性，酶对底物的催化具有特异性，电化学酶生物传感器将两者结合起来，可实现对样品的快速、特异、灵敏的检测。聚硫堇和碳纳米管都具有良好的导电性能，在生物传感器方面具有较广泛的应用。本文将聚硫堇和碳纳米管用作电子介体修饰于一次性电极表面，用溶胶凝胶将乙酰胆碱酯酶（AChE）固定在一次性电极上，利用AChE对氯化硫代乙酰胆碱的催化引起电极电流响应的变化，制成了新型酶生物传感器。实验表明该传感器响应快、灵敏度高、稳定性好，酶传感器在农药辛硫磷浓度为0.01μg/ml~300μg/ml范围内，抑制率与有机磷农药辛硫磷的浓度的对数呈良好的线性关系，线性方程式为：抑制率%=42.63+14.92logC，相关系数R=0.9866，最低检出限为0.0065μg/ml，有望用于有机磷农药残留的快速检测。
*查看完整论文请 +Q: 3 5 1 9 1 6 0 7 2
关键字:有机磷农药生物传感器碳纳米管聚硫堇
目录
1．引言 1
1.1 果蔬中有机磷农药残留现状及危害 1
1.2有机磷农药的检测方法研究进展 1
1.2.1 气相色谱法(GC) 1
1.2.2 高效液相色谱法(HPLC) 1
1.2.3 薄层色谱法(TLC) 2
1.2.4 酶抑制法 2
1.2.5 免疫法 3
1.2.6 其他方法 3
1.3 酶传感器的概述 4
2．实验部分 6
2.1 实验设计与原理 6
2.2 试剂与仪器 6
2.3 实验方法 7
2.3.1 碳纳米管的预处理 7
2.3.2 酶电极的制备 7
2.3.3 测定方法 7
3.结果与讨论 8
3.1 酶电极的电化学表征 8
3.1.1不同修饰阶段电极的循环伏安特性 8
3.1.2酶电极对底物溶液的响应 8
3.2电极修饰条件的优化 10
3.2.1 乙酰胆碱酯酶用量的优化 10
3.2.2 碳纳米管用量的优化 10
3.3酶电极反应条件的优化 11
3.3.1温度的优化 11
3.3.2 底液pH的优化 12
3.3.3 抑制时间的选择 13
3.4 有机磷农药抑制率曲线的建立 13
3.5酶传感器的稳定性及样品回收率试验 14
3.5.1酶传感器的重现性和稳定性 14
3.5.2 酶电极对蔬菜样品的回收率试验 15
4.结论 16
参考文献 17
致谢 19
1．引言
1.1 果蔬中有机磷农药残留现状及危害
目前有机磷农药在我国广泛用于植物病虫害的防治，对保证粮食丰收起着重要作用，但由此带来的农药残留问题不断显现，从而对人体健康产生危害。2005—2007 年，济南市对4个大型农贸市场销售的卷心菜、小白菜、韭菜等蔬菜进行了采样并进行检测，有机磷类农药总检出率32.66%，超标率25.63%，其中甲胺磷农药最高检出量为114.013mg/kg，氧化乐果最高检出量达到11.807%[1]。
有机磷农药比有机氯农药相对容易降解，而且药效较高，成本低廉[2]。但有机磷农药达一定量也有着较高的毒性,一旦进入人体可以使中枢神经系统及胆碱能神经呈过度兴奋状态，从而出现了中毒症状，而小剂量的长期摄入也导致心脏、肝脏、生殖系统等的慢性损害。
1.2有机磷农药的检测方法研究进展
目前有机磷农药的主要分析方法以色谱法为主，其他还有酶抑制法、免疫法等多种方法来。
1.2.1 气相色谱法(GC)
气相色谱法(Gas chromatography)是根据分析物质在固定相和流动相之间的分配系数的不同达到分离目的，并将分析物质的浓度转换成易被测量的电信号，然后送到记录仪记录下来的一类分离分析方法。帕尔哈提[3]利用TRACE CC2000气相色谱仪和NPD检测器等，对甲胺磷、对硫磷等九种农药的残留量（蔬菜）进行了检测和分析，回收率达到了81.5%-104.4%，最低检测限也达到了0.005mg/L，显示了不错的效果。气相色谱分离效率高、选择性较强、灵敏度相对较高、分析速度快等显著的特点，目前已应用于众多领域。但所需仪器昂贵，设备笨重，只能用于实验室和研究机构的常规测定。
1.2.2 高效液相色谱法(HPLC)
高效液相色谱法(HPLC)应用范围很广，经过数十年的发展，逐渐得到完善。因其具有的应用颗粒细、固定相也非常规则均匀、分离效率又高等特点，在农药残留检测方面也极有应用性。包宏[4]等利用Waters HPLC等仪器对西红柿中的克线磷的残留量进行了检测，回收率达到了83.9%~91.4%，具有良好的效果。高效液相色谱法具有简单方便、灵敏度高、重现性好等优点，一直被广泛使用，但仪器昂贵，设备笨重，只能用于实验室和研究机构的常规测定。
1.2.3 薄层色谱法(TLC)
薄层色谱法(Thin-Layer Chromatography)是通过提高薄层板的有效板数来改变薄层板的分离能力的一种在传统的色谱法的基础上加以改进优化的色谱法。对仪器的要求不高，但检测时的灵敏度不高。樊玮[5]等利用CAMAG TLC Scanner薄层扫描仪，测定了茶叶中的农药（高效氯氟氰菊酯、联苯菊酯）残留，回收率达到了82.1%~105%和75.2%~98.6%，实验中的准确性和重现性等也达到了农残分析的基本要求。
1.2.4 酶抑制法
有机磷农药可以抑制胆碱酯酶的活性，酶抑制技术(Enzyme Inhibition)利用了这一原理来检测分析果蔬食品中农药残留量的技术。Akkad R［6］等测定有机磷农药时利用了该技术，各项指标基本达到了农药残留的要求。该法对仪器的要求不高，操作简单效率高效，但灵敏度不强，重复性、回收率还有待提高。
生物传感器就是利用了酶抑制技术的原理研究出来的，利用传感器输出的信号（电压、频率等）进行定性和定量的检测。干宁等[7]采用纳米修饰电极制成了生物传感器，通过乙酰胆碱反应时间-电流图，得出了一定的线性关系，再通过有机溶剂对酶的影响实验和酶电极对有机磷类农药进行检测，得出了不错的结果。还有陈向强等[8]也通过制备电极进行了电流电位等实验，应用到了农药检测的领域。
另外，吕延成等[9]对ph、缓冲液浓度等条件对乙酰胆碱酯酶的固定化条件进行了研究，对利用酶活性而制成的生物传感器研究提供了依据。
近来，由于碳纳米管的优良电催化性能，也被应用到了生物传感器的研制中。刘润等[10]用碳纳米管修饰电极制成的生物传感器对辛硫磷和氧化乐果的加标回收率分别为104.5%和97.5%，显示了良好的应用前景。
对于检测有机磷来说，生物传感器有着很大的优势，比如：较小的体积、低廉的成本、选择性及抗干扰能力强、响应快，多个样品也能同时被检测，还有着较高的灵敏度。近年来, 生物传感技术得到了更广泛的研究和应用。
1.2.5 免疫法
免疫法根据标记物的不同主要分为两种免疫分析技术，一种为RIA（放射免疫)，另一种为EIA（酶免疫分析)。其原理均为通过抗体与抗原之间有特异性结合对物质进行定量的分析。由于RIA在免疫分析时存在一些问题，比如：放射性保护和废物处理等，现在的农药分析主要以EIA为主。Liang[11]等人建立了一种广谱特异性的间接竞争ELSIA，能检测多种有机磷农药。对中国大白菜进行马拉硫磷、乐果、乙酰奋乃静的回收检测，回收率为77.11% -104.17%。
1.2.6 其他方法
近些年来发展起来了一些新型农药检测技术，太赫兹时域光谱技术就是其中一种。该技术有着样品制备简单、波能量低、信噪比高、检测速度快等特点。颜志刚［12］等通过研究乙酰甲胺磷的太赫兹光谱，实验结果较为理想，为食品中农药残留的检测提供了理论依据。
综述以上各种检测方法，气相色谱和高效液相色谱所需仪器昂贵，设备笨重，只能用于实验室和研究机构的常规测定。薄层色谱对仪器要求不高，实际操作也简便，但灵敏度不高。酶抑制技术所用仪器较为廉价，实际操作也便于学习和掌握，但在灵敏度、重复性、回收率方面还有发展的空间。免疫分析法所需的实验设备简单并且安全廉价，检验灵敏，实验过程也快速准确，但需要专业技术人员, 应用较少，不易推广。开发出简便、快捷、灵敏的检测技术，已成为当今研究的重点。
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