肉源性单增李斯特菌毒力特性分析
摘要：单核细胞增生性李斯特菌(Listeria monocytogenes，LM)是一种重要的食源性人畜共患病原菌，可引起脑膜炎、败血症、流产等疾病。虽然LM引起的食源性疾病发病率不高，死亡率却高达30%。WHO也将其列为20世纪90年代食品四大致病菌之一。由于不同来源LM的毒力和致病性有所不同，因此对食品中分离得到的单增李斯特菌的毒力分析很有必要。本实验主要分析、研究了LM的主要毒力基因以及用多重PCR方法检测59株单增李斯特菌的血清型。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言 1
1 材料与方法 5
1.1材料与试剂 5
1.2仪器与设备 5
2方法 6
2.1菌株分离纯化 6
2.2菌株的保存 6
2.3菌株的活化 6
2.4 DNA的提取 6
2.5普通PCR 6
2.6 琼脂电泳..7
2.7 多重PCR.7
3结果与分析 9
3.1分离纯化得到59株单增李斯特菌 9
3.2 59株单增李斯特菌毒力基因PCR结果 9
3.3 59株单增李斯特菌的血清型结果..9
结论...10
致谢...11
参考文献...11
肉源性单增李斯特菌毒力特性分析
引言
引言：单核细胞增生性李斯特菌(Listeria monocytogenes，LM)是一种重要的食源性人畜共患病原菌，可引起脑膜炎、败血症、流产等疾病。虽然LM引起的食源性疾病发病率不高，死亡率却高达30%。WHO也将其列为20世纪90年代食品四大致病菌之一。单增李斯特菌是一种嗜冷微生物，也是重要的食源性人畜共患病原菌，广泛存在于土壤、植物、污水中，易对肉制品、海产品、牛奶蔬菜等造成污染[1]。该菌为兼性厌氧的革兰氏阳性菌，无芽孢，无夹膜[2]，能在低温条件下生长（1.5℃45℃生长，20℃可以存活一年)、耐高盐、耐低pH，可以形成生物膜[3]，对环境的适应能力很强，可以在食品的原料、加工、运输、冷藏过
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: ￥3^5`1^9`1^6^0`7^2$
程中交叉污染。由LM引起的食源性疾病在欧美国家[4][5][6]和中国[7]相继爆发。食用了被污染的食品后，健康人群易发生类似流感的症状，胃肠炎；孕妇、老人、婴儿等免疫力低下的人群易出现为脑膜炎、败血症、坏死性肝炎、神经症状及单核细胞增多等[8]，死亡率高达20%30%[9]。由于不同来源LM的毒力和致病性有所不同，因此对食品中分离得到的单增李斯特菌的毒力分析很有必要。
由于单增李斯特菌广泛的存在于自然界中，可在极端的环境中生长，使它很难在食物链中去除，随意其可在各种食品中造成危害。次从1981年来加拿大41人因食用单增李斯特菌污染的凉拌卷心菜发生食品中毒以来，欧美一些国家曾多次发生单增李斯特菌的食物中毒。我国主要以煮食为主，单增李斯特菌对热比较敏感，煮食可杀灭细菌。欧美国家曾多次因此发生单增李斯特菌引起的食物中毒，食源性单增李斯特菌已经成为一个公共的卫生问题。我国从年开始将食品中单增李斯特氏菌的检测纳入食品安全风险监测网,近年来对单增李斯特氏菌的研究虽多,但大多停留在污染监测上,在分离菌株的致病性及菌株间相关性研究上还不完善,从而限制其溯源及鉴定能力。单增李斯特菌分离株因来源不同,在致病力上表现出巨大的差异,有的菌株致病性强,有的很弱甚至无致病性。因此,准确、快速的鉴别单增李斯特氏菌的致病力对于食品安全风险的评估具有重要意义,其可对该地区单增李斯特氏菌的流行趋势进行预测并做好相对的应对措施,进一步避免食源性疾病的爆发。
随着冷藏、速冻食品越来越多，对单增李斯特菌的监控也越来越严格。然而有些菌株毒力很强，有些菌株毒力较弱。为了区分不同来源菌株的毒力，可以采用体内毒力实验、体外细胞实验、PCR检测毒力基因、检测毒素和DNA序列分析的方法。因此，本课题采用PCR毒力基因的方法分析不同来源的肉源单增李斯特菌的毒力。
单增李斯特菌的主要毒力基因
LM在细胞间的感染过程及其致病过程分为三个阶段：首先LM被吞噬细胞吞噬，在内化素A(InlA)、内化素B(InlB)、P60蛋白等粘附分子的帮助下黏附于细胞上。其次，LM在磷脂酶A(PlcA)、磷脂酶B(PlcB)和溶血素(LLO)的协同作用下裂解吞噬体膜。进入胞质后细菌在LM己糖磷酸盐转运蛋白(Hpt)的作用下摄取养分存活增殖。最后，LM在肌动蛋白聚合蛋白(ActA)的辅助下在细胞内运动，并伸出伪足向邻近的细胞扩散，使细菌在宿主细胞间传播。
与环境抗逆相关的毒力因子
细菌进入宿主的消化道后，要承受胃酸环境和胆酸盐、非特异性炎性因子和蛋白水解酶的破坏作用。胆酸盐水解酶BSH(Bile salt hydrolase)可以分解已经结合的胆酸盐，保护细菌不会受到胆酸盐的杀伤作用[10]。排除胆汁蛋白bilE (Bile exclusion)可以帮助将胆碱盐排出系统抵抗胆汁[11]。甜菜碱转运子BetL (Betaine transporter)[12]、甘氨酸甜菜碱转运子Gbu(Glycine betaine porter)[13]、肉碱转运子OpuC可以产生渗透物摄取系统，保证单增李斯特菌能够抗逆高渗透压环境。
与粘附侵袭相关的毒力因子
细菌通过与粘附和侵袭相关的毒力因子，入侵进入细胞。内化素是一类与黏附侵袭相关性很大的毒力因子，它能够识别宿主细胞上的受体，从而完成细菌对靶细胞的内化入侵[14]。细胞壁水解酶P60介导单增李斯特菌入侵非专职吞噬细胞，为该菌细胞分裂所必需[15]。酰胺酶Ami裂解细胞壁并通过其细胞壁锚定使细菌黏附至靶细胞表面[16]。溶血素LLO 可以溶解细胞吞噬体膜而使LM逃离吞噬体，促进菌体进入胞液，是细菌可以在细胞内生存的重要前提。除此之外，还有纤连蛋白结合蛋白FbpA、自溶素aut等毒力因子都协同参与了细菌的黏附和侵袭。
细胞内感染相关毒力因子
单增李斯特菌在真核细胞内的感染周期与多个因素相关，比如它在细胞内的生存、增殖能力及在细胞间的扩散能力。在溶血素(LLO)和磷脂酰肌醇特异性磷脂酶PIPLC的裂解作用下，LM可以从吞噬小体逃离接着进入细胞质中。在己糖磷酸盐转运蛋白Hpt的作用下，利用细胞质中的营养成分进行增殖[17]。与此同时，借助肌动蛋白聚集因子ActA实现细菌在细胞内和细胞间的扩散，其中磷脂酰肌醇特异性卵磷脂酶PlcB和 LLO介导细胞膜的裂解。细菌被临近的细胞吞噬后，便又开始了新一轮的感染。
毒力调控因子
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言 1
1 材料与方法 5
1.1材料与试剂 5
1.2仪器与设备 5
2方法 6
2.1菌株分离纯化 6
2.2菌株的保存 6
2.3菌株的活化 6
2.4 DNA的提取 6
2.5普通PCR 6
2.6 琼脂电泳..7
2.7 多重PCR.7
3结果与分析 9
3.1分离纯化得到59株单增李斯特菌 9
3.2 59株单增李斯特菌毒力基因PCR结果 9
3.3 59株单增李斯特菌的血清型结果..9
结论...10
致谢...11
参考文献...11
肉源性单增李斯特菌毒力特性分析
引言
引言：单核细胞增生性李斯特菌(Listeria monocytogenes，LM)是一种重要的食源性人畜共患病原菌，可引起脑膜炎、败血症、流产等疾病。虽然LM引起的食源性疾病发病率不高，死亡率却高达30%。WHO也将其列为20世纪90年代食品四大致病菌之一。单增李斯特菌是一种嗜冷微生物，也是重要的食源性人畜共患病原菌，广泛存在于土壤、植物、污水中，易对肉制品、海产品、牛奶蔬菜等造成污染[1]。该菌为兼性厌氧的革兰氏阳性菌，无芽孢，无夹膜[2]，能在低温条件下生长（1.5℃45℃生长，20℃可以存活一年)、耐高盐、耐低pH，可以形成生物膜[3]，对环境的适应能力很强，可以在食品的原料、加工、运输、冷藏过
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: ￥3^5`1^9`1^6^0`7^2$
程中交叉污染。由LM引起的食源性疾病在欧美国家[4][5][6]和中国[7]相继爆发。食用了被污染的食品后，健康人群易发生类似流感的症状，胃肠炎；孕妇、老人、婴儿等免疫力低下的人群易出现为脑膜炎、败血症、坏死性肝炎、神经症状及单核细胞增多等[8]，死亡率高达20%30%[9]。由于不同来源LM的毒力和致病性有所不同，因此对食品中分离得到的单增李斯特菌的毒力分析很有必要。
由于单增李斯特菌广泛的存在于自然界中，可在极端的环境中生长，使它很难在食物链中去除，随意其可在各种食品中造成危害。次从1981年来加拿大41人因食用单增李斯特菌污染的凉拌卷心菜发生食品中毒以来，欧美一些国家曾多次发生单增李斯特菌的食物中毒。我国主要以煮食为主，单增李斯特菌对热比较敏感，煮食可杀灭细菌。欧美国家曾多次因此发生单增李斯特菌引起的食物中毒，食源性单增李斯特菌已经成为一个公共的卫生问题。我国从年开始将食品中单增李斯特氏菌的检测纳入食品安全风险监测网,近年来对单增李斯特氏菌的研究虽多,但大多停留在污染监测上,在分离菌株的致病性及菌株间相关性研究上还不完善,从而限制其溯源及鉴定能力。单增李斯特菌分离株因来源不同,在致病力上表现出巨大的差异,有的菌株致病性强,有的很弱甚至无致病性。因此,准确、快速的鉴别单增李斯特氏菌的致病力对于食品安全风险的评估具有重要意义,其可对该地区单增李斯特氏菌的流行趋势进行预测并做好相对的应对措施,进一步避免食源性疾病的爆发。
随着冷藏、速冻食品越来越多，对单增李斯特菌的监控也越来越严格。然而有些菌株毒力很强，有些菌株毒力较弱。为了区分不同来源菌株的毒力，可以采用体内毒力实验、体外细胞实验、PCR检测毒力基因、检测毒素和DNA序列分析的方法。因此，本课题采用PCR毒力基因的方法分析不同来源的肉源单增李斯特菌的毒力。
单增李斯特菌的主要毒力基因
LM在细胞间的感染过程及其致病过程分为三个阶段：首先LM被吞噬细胞吞噬，在内化素A(InlA)、内化素B(InlB)、P60蛋白等粘附分子的帮助下黏附于细胞上。其次，LM在磷脂酶A(PlcA)、磷脂酶B(PlcB)和溶血素(LLO)的协同作用下裂解吞噬体膜。进入胞质后细菌在LM己糖磷酸盐转运蛋白(Hpt)的作用下摄取养分存活增殖。最后，LM在肌动蛋白聚合蛋白(ActA)的辅助下在细胞内运动，并伸出伪足向邻近的细胞扩散，使细菌在宿主细胞间传播。
与环境抗逆相关的毒力因子
细菌进入宿主的消化道后，要承受胃酸环境和胆酸盐、非特异性炎性因子和蛋白水解酶的破坏作用。胆酸盐水解酶BSH(Bile salt hydrolase)可以分解已经结合的胆酸盐，保护细菌不会受到胆酸盐的杀伤作用[10]。排除胆汁蛋白bilE (Bile exclusion)可以帮助将胆碱盐排出系统抵抗胆汁[11]。甜菜碱转运子BetL (Betaine transporter)[12]、甘氨酸甜菜碱转运子Gbu(Glycine betaine porter)[13]、肉碱转运子OpuC可以产生渗透物摄取系统，保证单增李斯特菌能够抗逆高渗透压环境。
与粘附侵袭相关的毒力因子
细菌通过与粘附和侵袭相关的毒力因子，入侵进入细胞。内化素是一类与黏附侵袭相关性很大的毒力因子，它能够识别宿主细胞上的受体，从而完成细菌对靶细胞的内化入侵[14]。细胞壁水解酶P60介导单增李斯特菌入侵非专职吞噬细胞，为该菌细胞分裂所必需[15]。酰胺酶Ami裂解细胞壁并通过其细胞壁锚定使细菌黏附至靶细胞表面[16]。溶血素LLO 可以溶解细胞吞噬体膜而使LM逃离吞噬体，促进菌体进入胞液，是细菌可以在细胞内生存的重要前提。除此之外，还有纤连蛋白结合蛋白FbpA、自溶素aut等毒力因子都协同参与了细菌的黏附和侵袭。
细胞内感染相关毒力因子
单增李斯特菌在真核细胞内的感染周期与多个因素相关，比如它在细胞内的生存、增殖能力及在细胞间的扩散能力。在溶血素(LLO)和磷脂酰肌醇特异性磷脂酶PIPLC的裂解作用下，LM可以从吞噬小体逃离接着进入细胞质中。在己糖磷酸盐转运蛋白Hpt的作用下，利用细胞质中的营养成分进行增殖[17]。与此同时，借助肌动蛋白聚集因子ActA实现细菌在细胞内和细胞间的扩散，其中磷脂酰肌醇特异性卵磷脂酶PlcB和 LLO介导细胞膜的裂解。细菌被临近的细胞吞噬后，便又开始了新一轮的感染。
毒力调控因子
版权保护: 本文由 hbsrm.com编辑，转载请保留链接: www.hbsrm.com/swgc/spzlyaq/332.html
