大闸蟹中嘌呤类物质的分布规律研究(附件)
本文研究用高效液相色谱法检测大闸蟹中嘌呤类物质的分布规律，采取高氯酸水解法提取大闸蟹中的嘌呤。实验以磷酸二氢钾-磷酸缓冲液（0.007mol/mL，pH=4）为流动相，色谱柱用Agilent XDB-C18（4.6mm×250mm，5.0μm），色谱条件为流速1.0mL/min，柱温25℃，进样量20uL，检测波长254nm。大闸蟹样品用10%（V/V）的高氯酸溶液沸水浴60min，再用甲酸和氢氧化钾调pH至4.0。定容后用液相色谱仪分析大闸蟹的各个可食用部位的四种嘌呤分布规律，研究在不同加工条件下各个嘌呤含量的变化规律。以此研究数据让痛风患者或者有痛风倾向的人拥有合理健康的膳食，并为预防痛风和减少痛风发病率提供依据。关键词 大闸蟹，嘌呤，高效液相色谱法，痛风
目 录
1 引言 1
1.1 嘌呤的代谢与痛风 1
1.2 嘌呤检测研究现状 2
1.3 食品中嘌呤含量现状研究 3
1.4 本研究的目的和意义 4
2 实验试剂与材料 4
2.1 实验原料 4
2.2 实验试剂 4
2.2 实验仪器 5
3 实验方法 5
3.1 样品前处理 5
3.2 配制实验溶液 5
3.3 仪器参考条件 6
3.4 水解提取方法 6
3.5 大闸蟹的水煮加工方法 6
4 结果与分析 7
4.1 色谱条件的选择 7
4.2 标准液检测 8
4.3 精密度检测 9
4.4 样品提取方法的选择 9
4.5 样品水解方法的选择 11
4.6 大闸蟹不同部位的嘌呤类物质的分布规律 12
4.7 在水煮加工过程中大闸蟹嘌呤类物质的变化 13
结 论 18
致 谢 19
参 考 文 献 20
1 引言
嘌呤这种生物碱是核酸的重要构成部分，它主要包含鸟嘌呤、黄嘌呤、次黄嘌呤、腺嘌呤和其他衍生物。它在能量的供给、代谢的调节和辅酶的组成等各种生 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ￥351916072￥
命现象中起着很关键的作用。大闸蟹的营养丰富，它富含蛋白质，氨基酸，以及钙、铁、锌、镁、碘等矿物质和维生素A族等成分，但这营养丰富的大闸蟹却不适合所有人食用，因为大闸蟹中的高嘌呤食物且胆固醇含量也过高，摄入过多会使体内嘌呤含量升高，导致嘌呤氧化产物尿酸的沉积，从而引起痛风[21]。
嘌呤是由嘧啶环和咪唑环稠和而形成的杂环化合物，分子结构如图1。
图1 嘌呤的结构式
1.1 嘌呤的代谢与痛风
人体内的嘌呤主要有四种，其中，腺嘌呤和鸟嘌呤是以遗传物质核酸的碱基化合物的形式稳定存在，黄嘌呤和次黄嘌呤则一般是以游离嘌呤存在，是嘌呤分解代谢的中产物，其结构式如图2。嘌呤虽然在人体内中发挥着重要的生理作用，给人体各个组织提供和传递遗传信息，为了维持细胞活力提供能量，但是过高的嘌呤在人体内会给肾脏的代谢造成负担。
嘌呤本身不存在于自然界中，但其衍生物如腺嘌呤，鸟嘌呤等在人体内最终是会以尿酸的形式存在，最终会经肾脏和肠道排出体外，但在摄入高嘌呤食物后，肾脏如果不能及时排出体外，则会形成生理系统紊乱。尿酸长期地沉积在人体关节、肾脏、软骨及其他身体部位，久而久之引发痛风。由此可知痛风的产生与人体能否正常代谢掉摄入和合成的尿酸密切相关，是一个慢慢积累的过程，而非一蹴而就造成的急性病症。人体代谢会让嘌呤核苷酸被水解成鸟嘌呤和腺嘌呤，或者经脱氨作用生产黄嘌呤，而从食物中也会摄入嘌呤，之后产生尿酸经肾脏从尿液排出。但是如果嘌呤过多，产生的尿酸也多。尿酸过多，打破了“出”和“入”的动态平衡，尿酸就会在体内蓄积。蓄积到一定浓度，尿酸会在人体内以结晶盐析出。所以，虽然嘌呤是一种基因控制的可遗传疾病，但是节制日常饮食中嘌呤的摄入，着重减少摄入高嘌呤食物，对控制痛风的病症的效果也是很显著的。对于有痛风病症的人来说，控制饮食，节制日常嘌呤的摄入，调整生活方式对缓解痛风有很好的效果[1~3]。
图2 四种主要嘌呤结构式
1.2 嘌呤检测研究现状
大闸蟹中的嘌呤大多数是以嘌呤碱基形式存在的，是以需要通过有效手段将嘌呤从大闸蟹的组织、细胞中提取出来，再进行分离分析[4]。目前可考的嘌呤的有效提取方法包含有酸水解法、超声提取法、有机溶剂萃取法、酶提取法和微波提取法等，本实验通过对前两种提取方法进行比较优化，以选取出能够提高嘌呤提取率和实验方法精确率的提取方法。嘌呤常采取微量定量检测，常用检测方式有高效液相色谱法、气相色谱法、离子色谱法和电泳法等。本实验运用的方法即高效液相色谱分析法[5~8]。
1.2.1 酸解提取法
（1）三氟乙酸和甲酸提取法
称取一定的大闸蟹组织捣碎样品置于玻璃试管中，向其加入一定量超纯水、三氟乙酸、甲酸后混匀，凌云等[6]就将甲酸、三氟乙酸、超纯水加入试管中，再将试管置于90℃水浴锅中水解并保持振荡12min以保证水解充分，混合物冷却后用旋转蒸发仪60℃蒸发至干，剩余物用磷酸二氢钾溶液复溶，再转移至1.5ml离心管，用高速冷冻离心机离心数分钟，吸取上清液过0.45μm滤膜后用于色谱分析[9~11]。
（2）高氯酸提取法
取一定量大闸蟹组织捣碎样品放入玻璃试管中，再加入10%（V/V）的高氯酸溶液振荡混匀后，用沸水浴水解60min，迅速冷却后用氢氧化钾调pH至7.0后，振荡混匀后，再用甲酸调pH至流动相的pH值数，再用磷酸二氢钾溶液定容至10ml，充分混匀过0.45μm滤膜待测[12~15]。
1.2.2 有机溶剂萃取法
有机溶剂萃取法是将多种有机液体试剂混合萃取，使嘌呤从大闸蟹的核酸中转移至萃取剂中以方便实验检测。比如有孙培龙等采用乙醇溶剂有效地从香菇及其他多种食用菌中萃取了香菇嘌呤[16]，Clariana[7]等提取猪肉及其制品中多种游离嘌呤类物质时采用甲醇、甲酸、丙酮和正己烷等多种溶剂混合的方法萃取嘌呤。虽然有机溶剂的混合萃取能有效分离和提取嘌呤，但是操作较为繁琐，有机溶剂间的传质速率不同提取的嘌呤含量不稳定，且大多有毒易挥发，因此采用率较少。
目 录
1 引言 1
1.1 嘌呤的代谢与痛风 1
1.2 嘌呤检测研究现状 2
1.3 食品中嘌呤含量现状研究 3
1.4 本研究的目的和意义 4
2 实验试剂与材料 4
2.1 实验原料 4
2.2 实验试剂 4
2.2 实验仪器 5
3 实验方法 5
3.1 样品前处理 5
3.2 配制实验溶液 5
3.3 仪器参考条件 6
3.4 水解提取方法 6
3.5 大闸蟹的水煮加工方法 6
4 结果与分析 7
4.1 色谱条件的选择 7
4.2 标准液检测 8
4.3 精密度检测 9
4.4 样品提取方法的选择 9
4.5 样品水解方法的选择 11
4.6 大闸蟹不同部位的嘌呤类物质的分布规律 12
4.7 在水煮加工过程中大闸蟹嘌呤类物质的变化 13
结 论 18
致 谢 19
参 考 文 献 20
1 引言
嘌呤这种生物碱是核酸的重要构成部分，它主要包含鸟嘌呤、黄嘌呤、次黄嘌呤、腺嘌呤和其他衍生物。它在能量的供给、代谢的调节和辅酶的组成等各种生 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ￥351916072￥
命现象中起着很关键的作用。大闸蟹的营养丰富，它富含蛋白质，氨基酸，以及钙、铁、锌、镁、碘等矿物质和维生素A族等成分，但这营养丰富的大闸蟹却不适合所有人食用，因为大闸蟹中的高嘌呤食物且胆固醇含量也过高，摄入过多会使体内嘌呤含量升高，导致嘌呤氧化产物尿酸的沉积，从而引起痛风[21]。
嘌呤是由嘧啶环和咪唑环稠和而形成的杂环化合物，分子结构如图1。
图1 嘌呤的结构式
1.1 嘌呤的代谢与痛风
人体内的嘌呤主要有四种，其中，腺嘌呤和鸟嘌呤是以遗传物质核酸的碱基化合物的形式稳定存在，黄嘌呤和次黄嘌呤则一般是以游离嘌呤存在，是嘌呤分解代谢的中产物，其结构式如图2。嘌呤虽然在人体内中发挥着重要的生理作用，给人体各个组织提供和传递遗传信息，为了维持细胞活力提供能量，但是过高的嘌呤在人体内会给肾脏的代谢造成负担。
嘌呤本身不存在于自然界中，但其衍生物如腺嘌呤，鸟嘌呤等在人体内最终是会以尿酸的形式存在，最终会经肾脏和肠道排出体外，但在摄入高嘌呤食物后，肾脏如果不能及时排出体外，则会形成生理系统紊乱。尿酸长期地沉积在人体关节、肾脏、软骨及其他身体部位，久而久之引发痛风。由此可知痛风的产生与人体能否正常代谢掉摄入和合成的尿酸密切相关，是一个慢慢积累的过程，而非一蹴而就造成的急性病症。人体代谢会让嘌呤核苷酸被水解成鸟嘌呤和腺嘌呤，或者经脱氨作用生产黄嘌呤，而从食物中也会摄入嘌呤，之后产生尿酸经肾脏从尿液排出。但是如果嘌呤过多，产生的尿酸也多。尿酸过多，打破了“出”和“入”的动态平衡，尿酸就会在体内蓄积。蓄积到一定浓度，尿酸会在人体内以结晶盐析出。所以，虽然嘌呤是一种基因控制的可遗传疾病，但是节制日常饮食中嘌呤的摄入，着重减少摄入高嘌呤食物，对控制痛风的病症的效果也是很显著的。对于有痛风病症的人来说，控制饮食，节制日常嘌呤的摄入，调整生活方式对缓解痛风有很好的效果[1~3]。
图2 四种主要嘌呤结构式
1.2 嘌呤检测研究现状
大闸蟹中的嘌呤大多数是以嘌呤碱基形式存在的，是以需要通过有效手段将嘌呤从大闸蟹的组织、细胞中提取出来，再进行分离分析[4]。目前可考的嘌呤的有效提取方法包含有酸水解法、超声提取法、有机溶剂萃取法、酶提取法和微波提取法等，本实验通过对前两种提取方法进行比较优化，以选取出能够提高嘌呤提取率和实验方法精确率的提取方法。嘌呤常采取微量定量检测，常用检测方式有高效液相色谱法、气相色谱法、离子色谱法和电泳法等。本实验运用的方法即高效液相色谱分析法[5~8]。
1.2.1 酸解提取法
（1）三氟乙酸和甲酸提取法
称取一定的大闸蟹组织捣碎样品置于玻璃试管中，向其加入一定量超纯水、三氟乙酸、甲酸后混匀，凌云等[6]就将甲酸、三氟乙酸、超纯水加入试管中，再将试管置于90℃水浴锅中水解并保持振荡12min以保证水解充分，混合物冷却后用旋转蒸发仪60℃蒸发至干，剩余物用磷酸二氢钾溶液复溶，再转移至1.5ml离心管，用高速冷冻离心机离心数分钟，吸取上清液过0.45μm滤膜后用于色谱分析[9~11]。
（2）高氯酸提取法
取一定量大闸蟹组织捣碎样品放入玻璃试管中，再加入10%（V/V）的高氯酸溶液振荡混匀后，用沸水浴水解60min，迅速冷却后用氢氧化钾调pH至7.0后，振荡混匀后，再用甲酸调pH至流动相的pH值数，再用磷酸二氢钾溶液定容至10ml，充分混匀过0.45μm滤膜待测[12~15]。
1.2.2 有机溶剂萃取法
有机溶剂萃取法是将多种有机液体试剂混合萃取，使嘌呤从大闸蟹的核酸中转移至萃取剂中以方便实验检测。比如有孙培龙等采用乙醇溶剂有效地从香菇及其他多种食用菌中萃取了香菇嘌呤[16]，Clariana[7]等提取猪肉及其制品中多种游离嘌呤类物质时采用甲醇、甲酸、丙酮和正己烷等多种溶剂混合的方法萃取嘌呤。虽然有机溶剂的混合萃取能有效分离和提取嘌呤，但是操作较为繁琐，有机溶剂间的传质速率不同提取的嘌呤含量不稳定，且大多有毒易挥发，因此采用率较少。
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