芽孢漆酶对蛋白加工性能的影响
摘要：乳清蛋白的抗氧化性、乳化性、乳化稳定性、起泡性等功能特性在食品工业中被广泛地应用，并且这些特性在乳清蛋白进行修饰之后会发生改变。其中利用漆酶等酶进行酶法修饰是一种很有前景的方法。漆酶对乳清蛋白的修饰是通过催化氧化乳清蛋白发生交联形成聚合物实现的。并且这种能力在儿茶素的存在下，可以得到大大的提高。与真菌漆酶比较，芽孢漆酶的热稳定性更好。所以本实验利用芽孢漆酶在儿茶素存在下设置不同反应温度进行乳清蛋白的氧化修饰，以观察芽孢漆酶对蛋白加工性能的影响。并得到如下实验结果：（1）、乳清蛋白在芽孢漆酶改性之后，抗氧化性提高了13.74%~23.18%、起泡性提高了10.91%~23.49%和起泡性稳定性提高了4.97%~8.77%，乳化性降低了2.22% ~ 13.89%、乳化稳定性降低了10.62%~49.07%，热稳定性降低了24.22%~66.23%以及溶解性降低了14.49%~21.17%。（2）、较高的反应温度，缩短反应时间，依旧可以达到这样的效果，抗氧化性提高了、起泡性提高了和起泡性稳定性提高了，乳化性降低了、乳化稳定性降低了以及溶解性降低了。（3）、儿茶素的加入也使乳清蛋白的抗氧化性、起泡性和起泡性稳定性提高，使乳化性、乳化稳定性以及溶解性降低。关键字：芽孢漆酶；乳清蛋白；功能特性Effect of Bacillus Laccase on the Processing Properties of ProteinStudent majoring in Food quality and safety Zheng MeixiaTutor Zhang ChongAbstract：Whey protein has a wide range of applications in the food industry owe to its functional properties, such as antioxidant activity, emulsification, emulsion stability, foaming ability and so on . These functional properties, will be changed after the modification of the whey protein. And enzym
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072*
atic modification is a promising way to modify whey protein compared with other ways. From the previous studies ,we can know enzymes such as laccase, which have the ability to modify the whey protein modification, can catalyze the oxidation of whey proteins to form a polymer changing its functional properties . And the ability can be greatly improved in the presence of the Catechin. So when we want to enzymaticly modify the whey protein ,we usually add the Catechin to greatly speed up the rate of the reaction. And compared with fungal laccase, Bacillus laccase has a better thermal stability. In order to observe the effect of laccase on protein processing performance,the experiment with Bacillus laccase in the presence of Catechin in a different reaction temperature for the oxidation of whey protein modification has been done. Finally,we can get results : (1)、whey protein modified with laccase has a higher antioxidant（increasing by 13.74%~23.18%, foaming (increasing by 10.91%~23.49%)and foaming stability (increasing by 4.97%~8.77%) and a lower emulsifying(decreasing by 2.22% ~ 13.89%), emulsifying stability (decreasing by 10.62%~49.07%) ,solubility(decreasing by 14.49%~21.17%) and thermal stability (24.22%~66.23%) . （2）、whey protein modified in a higher reaction temperature can get the same results and effectively shorten the time required for the reaction. (3)、whey protein reacts with the Catechin also can get a higher antioxidant, foaming ability and foaming stability and a lower emulsifying, emulsifying stability ,solubility and thermal stability . 牛乳中酪蛋白在沉淀分离时，在上清液中的多种蛋白质组分：β-乳球蛋白、α-乳白蛋白等被统称为乳清蛋白，它的含量大约为牛乳总重量的0.7％[1]。它具有很多的功能特性。（1）、成胶性：乳清蛋白在加热后形成热诱导性的凝胶。成胶作用受温度以及蛋白质的质量分数影响。其中最佳的成胶条件是：温度为70℃-90℃，蛋白质质量分数为10%-20%，酸性条件（pH 4.6-6.0）。（2）、搅打起泡性：搅打起泡性就是，乳清蛋白在形成泡沫的时候，会具有表面活性作用，可以起泡。（3）乳化性：乳清蛋白既含有亲水基团，又含有疏水基团，这一特点使乳清蛋白具有乳化性。（4）涂层性：用乳清蛋白制成可食用性的膜。这种膜可以优化产品的外观、提高产品的稳定性、改善产品的口感以及保护产品的风味和香味。例如当应用在以花生这类坚果作为原料的一些食品中时，它可以很有效地降低产品哈败的速度，使食品体系中的坚果仍然能够保持它的脆性。（5）微胶束化：微胶束化就是利用乳清蛋白它的成膜性能，将挥发性物质进行微胶束化[2]。 但是乳清蛋白也存在一些问题：（1）、是一种常见的过敏原，引起牛乳过敏。其中的β- 乳球蛋白是引起牛乳过敏的主要成分，其次为α- 乳白蛋白[3]。（2）、蛋白质含有氨基和羰基，因此，在在升高温度的时候，它会发生分解缩合，最终缩合成不溶解的褐色产物类黑素，即发生了美拉德反应，会对产品的色泽造成一定的影响。这些问题可以通过乳清蛋白的改性得以解决，并且同时改善乳清蛋白的一些功能特性[4]。 改性的方法有物理改性、化学改性和酶法改性。这些改性方法是通过改变乳清蛋白的分子大小以及氨基酸的组成和顺序、结构、表面静电荷和疏水基团这些方面来达到增强或改善其乳清蛋白功能特性的目的。其中物理改性方法，包括热处理、高压、质构化以及超临界二氧化碳流体处理等[5].化学改性包括：酰化、磺化、磷酸化、糖基化、脱酰胺[6,7]。酶法改性包括：蛋白质聚合交联作用、蛋白质水解作用[8]。 在这些改性方法中，因化学改性和物理改性（非酶法改性）反应简单、应用广泛和效果显著，该方法是目前用的较多的乳清蛋白改性技术。但是该方法也存在着反应条件苛刻，试剂专一性不强，最终产品中除去未反应试剂较困难等一些不足之处。相比非酶法改性，酶法改性具有酶源易得、反应速度快、条件温和、专一性强、成本相对可以接受、应用更安全、可将蛋白质改性到所期望的功能等优点，并且目前国内外很多科研人员都在进行酶法改性的研究，使该法得到了很大的发展。更重要的是，目前，消费者都对具有高营养价值、安全卫生和抗过敏等特点的新型食品给予越来越多的重视，由于酶法在生产过程表现出的反应条件的温和性和副产物少的专一性，因此采用酶技术生产或改造新型食品具有很重要的发展潜力[4] 。除此以外，酶法改性还可以降低牛乳清蛋白的免疫原性，减少婴幼儿的过敏反应[3]。 漆酶( laccase，苯二醇，氧化还原酶，EC1. 10. 3. 2) 是一种含铜多酚氧化酶，它与植物中的抗坏血酸氧化酶(ascorbieacidoxidase)以及哺乳动物中的血浆铜蓝蛋白(ceruloplasmin)是同源的，都是蓝铜氧化酶( bluecopperoxidase) 家族中的一员[9, 10]，可利用分子氧作为电子的受体去氧化多种类型的酚类化合物及一些非酚类的化合物，将分子氧还原为水[11]。漆酶与过氧化物酶和酪氨酸酶共同组成了酚类物质的氧化酶群[12]。 漆酶最早是在1883年被日本学者Yoshida发现的。由于是在日本漆树(Rhus vernicifera)的分泌液中发现的，所以在1894年，Bertrand将其命名为漆酶。大量的研究表明，漆酶广泛地存在于植物、真菌和细菌中，即植物漆酶、真菌漆酶和细菌漆酶[13-15]。 由于真菌漆酶比细菌漆酶更易得到，所以在目前的研究中，对真菌漆酶的研究更多，所以对真菌的结构更清楚，应用的也更多。相比真菌漆酶，细菌漆酶与之结构相似，同样含有4个铜结合位点，但是它们的全序列却是不同的。所以，其反应的条件以及动力学特征就会与真菌漆酶有所不同。其反应速度可能会变慢，因为Cu2+可能成为其中的必要元素。正是由于这些不同之处，细菌漆酶只能被称为“多酚氧化酶”或者“多铜氧化酶”，它也被称为漆酶类似物( lac-case-like)[12]。 然而，细菌漆酶相比真菌漆酶，它存在Cu2+抗性[16]、热稳定性好、不需糖基化[17]以及及酶活性的最适pH值范围更广[18]等优点。同时，相比真菌，细菌生长的代时更短，所需营养成分更简单易得，更便于大规模的培养；除此以外，细菌漆酶对热、卤素和碱的稳定性更好。因此，细菌漆酶的研究对漆酶应用的环境条件以及应用领域的扩展都具有十分重要的意义。并且本实验室在前期，已经通过筛选鉴定在死亡谷芽孢杆菌中发现了漆酶fmb-103，本实验的研究人员通过氮离子束诱变，已经获得了性状优良的突变株fmb-820，并且通过优化菌株fmb-820发酵条件，已经获得了其高产的条件，为漆酶的大规模生产以及它的应用都提供了基础。经过优化的重组漆酶发酵条件为：葡萄糖：0.0200g/50mL，酵母提取物：0.5200g/50mL，Cu2+：14.5400mmol/50mL[19]。1 材料与方法 1．1 材料1.1.1菌种由本学院酶工程实验室保藏的菌株fmb-820。1.1.2主要试剂 2, 2’-连氮-二(3-乙基苯并噻唑-6-磺酸)(ABTS) （Sigma公司产品）；氨苄青霉素（Amresco公司产品）；胰蛋白胨和酵母粉（Oxoid公司生产）；乳清蛋白（北京赢力康源国际贸易有限公司）；DPPH(梯希爱化成工业发展有限公司);其它常规试剂均为分析纯1.1.3培养基 LB培养基:10g 胰蛋白胨；10g NaCl；5g 酵母粉；1000 mL 蒸馏水。1.1.4实验仪器 SW-CJ-1FD型单人单面净化工作台： 苏州净化设备有限公司 培英HYL-A全温摇瓶柜： 太仓实验设备厂 UV-2450紫外可见分光光度计： 日本岛津公司 5804 R 高速冷冻离心机： Eppendorf 德国基因公司 JY91-ⅡDN超声波破碎仪： 宁波新芝生物科技股份有限公司1．2 方法1.2.1漆酶的发酵表达 发酵培养主要包括:(1)、种子液的培养、(2)、发酵液的培养（3）、发酵完成后需要对菌液进行离心、破碎等一些操作得到粗酶液（4）、85℃加热离心得到初步纯化的酶液（5）、在85℃测定酶活。种子液培养 将转导有解淀粉芽孢杆菌漆酶基因的大肠杆菌置于-70℃、50%甘油保存。在进行种子液培养时，以千分之一的接种量进行接种即20mL LB培养基中加入20μL甘油保存的菌种，与此同时加入10μL 浓度为200mg/mL氨苄青霉素，在37℃、180rpm条件下进行隔夜摇床培养。发酵液培养 仍然使用LB培养基为发酵液，以千分之一的接种量将种子液接种，50ml发酵液中加入50μL长好的种子液，同时加入200mg/mL氨苄青霉素25μL，37℃、180rpm摇床培养。 生长检测当发酵液菌体浓度达到OD600=0.6的时候进行诱导，通常37℃、180rpm摇床达到0.6吸光值需要3~4h。诱导时，无菌操作下在发酵液中加入25μL 200mg/mL氨苄青霉素和500μL 25mmol.L-1CuSO4 。然后将发酵液置于16℃、180rpm的条件下进行诱导表达，时间为6h。1.2.2漆酶的粗酶液的制备及漆酶的酶活的测定 漆酶在大肠杆菌中是以胞内酶的形式表达的，所以在提取漆酶粗酶液时候需要经过下面的一系列操作，具体操作如下： 取50mL的发酵液用离心机以转速8000rpm进行离心10min，弃上清液、收集菌体，再加入10ml 细胞裂解液（ pH=7.0 PBS磷酸缓冲液）进行菌体重悬。并用移液枪进行吹打，直至均匀。在吹打均匀之后，用超声破碎机进行超声破碎菌体（40w，超声1s，停顿2s，共超声30min）。在超声破碎结束后，用离心机（4℃、9000rpm）离心10min，收集上清液即为粗酶液。 利用芽孢漆酶高热稳定性，在85℃的高温下，其他酶都失活的情况下该酶仍然具有很高的酶活力这一特点。进行酶液的85℃的加热，来进行粗酶液的初步纯化，并且进行离心。得到上清液即为初步纯化的漆酶酶液。 在得到初步纯化的漆酶酶液之后，采用 Shin & Lee（2000）的 ABTS法，并稍作改动进行酶活的测定：先后加入2.45mL柠檬酸-磷酸盐缓冲液（ 0.2mol/L； pH 5.0）、 0.5mL ABTS（ 6mmol/L） 以及50μL用缓冲液适当稀释的漆酶初步纯化的酶液，在85℃下，以灭活的酶液做空白对照，测定反应的前 3min内，反应液在 420nm 处吸光值（OD)的增加量。每分钟内生成 1μmol 反应物所需的酶量即为一个酶活力单位。漆酶酶活计算公式：漆酶活力（U）=V总×ΔOD / ( V酶 ×ε×Δt× 10-6 )×总酶酶液稀释倍数；其中：ε=3.6 × 104mol/cm；Δt：3min；ΔOD：3min 内吸光度OD 的变化值；V总：反应中，反应液的总体积,3ml；V酶：酶反应中，酶液的体积,50μl。实验重复3次，取平均值。1.2.3漆酶与乳清蛋白反应 漆酶与乳清蛋白按照表1-1的条件进行反应。组号WPI/gEnzyme/U/mg milk proteinpHT/℃Catechin umol/mg milk protein反应时间/min未处理4.2127.4A4.2120.117.4800.0860B4.2120.117.4600.0860C4.2120.117.4400.0860D4.2120.117.4800.0830E4.2120.117.4600.0830F4.2120.117.4400.0830G4.2127.4800.0860H4.2127.4600.0860I4.2127.4400.0860J4.2127.4800.0830K4.2127.4600.0830L4.2127.4400.0830表1-1：芽孢漆酶与乳清蛋白反应条件表1.2.4冷冻干燥 将按表1-1反应条件进行乳清蛋白改性后得到的改性乳清蛋白的溶液—进行装盘，封上保鲜膜—用牙签戳出小孔—20℃冷冻一夜—然后放置于真空冷冻的干燥仓中—冻结到终温为-35℃—维持在-40℃左右进行升华干燥—温度设置在40"C进行解吸—出料，包装—最终就获得了改性的乳清蛋白粉。1.2.5漆酶与乳清蛋白反应的反应产物指标的测定 将上述改性的乳清蛋白粉进行以下指标的测定，以空白组作为对照。1.2.5.1热稳定性的测定 配制蛋白溶液（w/w=5%)，然后取5ml该蛋白质溶液置于玻璃试管中，用油浴锅设置温度140℃进行加热，记录开始加热到发生凝结所需的时间t，单位：s。1.2.5.2乳化性及乳化稳定性的测定 参考Pearce和Kinsella l978年提出的蛋白质乳化性的测定方法，并稍作改动，进行改性乳清蛋白的乳化性及乳化稳定性：（1）、样品的乳化：准确称取0．01 g样品—用柠檬酸一磷酸氢二钠缓冲液（pH 7）进行溶解并定容至10 mL—取3 mL该蛋白质溶液于塑料离心管中—然后加入1 mL花生油—之后以13 500 r／min的转速离心1min，进行改性乳清蛋白的乳化。（2）、吸光度的测定：在乳化之后立即从离心管底部吸取0．1ml乳浊液—加入SDS溶液（质量分数0．1％）进行稀释，稀释100倍—然后在直径1 cm的比色皿中在500 nm条件下测定其吸光值—经过30 min后，从离心管的底部再次吸取0．1 rnL乳浊液，进行第二次吸光值的测定。其中蛋白的乳化性用吸光度表示，蛋白的乳化稳定性(Es)为:Es=A0 T/(A0-At) 式中：Es为乳化稳定性(min)；T为两次测定乳化性的时间间隔(min)；A0为乳化之后第1次测定的乳浊液的吸光度值；At为30min后，第2次测定乳浊液的吸光度值。1.2.5.3起泡性的测定 准确称取乳清蛋白或改性乳清蛋白0．5 g，将其溶于50 mL 0．05 mol·L_1Tris—HCI缓冲液(pH 7．5)中，将其配制成一定浓度(1％)的溶液。取2 mL乳清蛋白-Tris-HCl溶液或改性乳清蛋白-Tris-HCl溶液，置于10 mL量筒中，进行上下震荡（l min），记录下0 min时的初始泡沫的体积，记为H0，然后静置10min后，再测量终止泡沫体积，记为H10。其中起泡性大小以H0作为评价的指标，起泡稳定性的大小则以H0/H10作为评价的指标。1.2.5.4溶解性的测定 利用双缩脲法，进行改性乳清蛋白的溶解性的测定。 (1)乳清蛋白标准溶液的配制：准确称取已经进行过微量凯式定氮测定的乳清蛋白，用NaOH溶液（0．05 mol／L）配制成标准溶液（蛋白质质量浓度为10g/L的）。 (2)标准曲线的测定：取12支试管分成2组，一组测定，一组平行。在每一组的6支试管中分别加入0ml，0．2ml，0．4ml，0．6ml，0．8ml，1．0 mL配制好的标准乳清蛋白溶液，然后用水补足到2 mL，各加入6.3ml双缩脲试剂(6mlA液+300μl的B液），并充分摇匀，然后在室温下，放置30 min，再于波长540 nm处进行比色测定，测定其吸光度值。取两组平均值，绘制标准曲线。 (3)改性乳清蛋白的溶解性大小的测定：准确称取0．5 g漆酶改性的乳清蛋白于80 mlL烧杯中．缓慢加入40ml的去离子水，然后将烧杯放在磁力搅拌器上进行搅拌，使漆酶改性的乳清蛋白充分地溶解（搅拌的速度以刚好不在溶液表面形成漩涡为宜）。搅拌1 h（在搅拌的过程中，用HCl溶液或NaOH溶液调节pH值），之后将溶液定容至50 mL。于4 000 r／min离心，离心时间为30 min。然后同样用双缩脲法测定漆酶改性的乳清蛋白的吸光度值，代入吸光度-乳清蛋白蛋白质含量的标准曲线，确定漆酶改性的乳清蛋白的浓度。然后代入公式，计算出蛋白质溶解性。蛋白质的溶解性为：漆酶改性的乳清蛋白蛋白质溶解性（%）=上清液中蛋白质的质量浓度（g/l) * 50 * 100 样品质量（mg) *样品蛋白质质量分数（%） 1001.2.5.5抗氧化性的测定参照saiga的方法，并略作修改，进行漆酶改性乳清蛋白的抗氧化性的测定。将样品配成20 g／L的质量浓度。取1．0 mL的样品液、4．0 mL浓度为0．1 mmol／L 的DPPH乙醇溶液(体积分数为95％)，混合均匀，在室温下避光反应30 min。用体积分数为95％的乙醇溶液作为参比。于波长517 nm处测定吸光度值。然后将吸光度值代入下面公式中，通过计算可以得到每种处理得到的改性乳清蛋白对DPPH自由基的清除率大小： DPPH清除率=(1一(Ai-Aj)) ×100 Ac该式中：Ai，为加入改性乳清蛋白样品液后的DpPH溶液的吸光度值；Aj为样品液的吸光值；Ac，为未加改性乳清蛋白样品液时的DPPH溶液的吸光度值。2 结果与分析 2．1 溶解性的变化图1-2-1蛋白质浓度的标准曲线图1-2-2乳清蛋白的溶解性变化图由图1-2-2可知，漆酶对乳清蛋白进行改性后，乳清蛋白的溶解性发生了明显的变化，即改性之后的乳清蛋白的溶解性有所下降。除此以外，通过该图还可以看到，加了儿茶素的比不加儿茶素的溶解性也有所下降。而且反应的温度和反应的时间也会影响乳清蛋白的溶解性的大小，即温度越高，改性乳清蛋白的溶解性下降得就越明显。并且在较高的温度下，可以用更短的反应时间，达到类似的效果。产生这样结果的原因：（1）、根据Beate Hiller等人之前的研究，产生这样的结果的原因是因为漆酶与乳清蛋白反应是聚合交联反应。在聚合交联反应之后，二硫键被氧化，乳清蛋白的结构就变得更不紧凑了，二级、三级结构暴露，从而使蛋白质的溶解性下降。（2）、高温下，也会引起乳清蛋白的交联聚合。（3）、根据Oluyemisi E. Adelaku 等人之前的研究，可以知道例如：阿魏酸，儿茶素这种酚酸在没有漆酶的存在下也会引起乳清蛋白的聚合。 2．2 乳化性及乳化稳定性的变化图2-2-1乳清蛋白乳化性变化图图2-2-2乳清蛋白乳化稳定性变化图由图2-2-1及2-2-2可以知道，漆酶对乳清蛋白进行改性后，会对乳清蛋白的乳化性以及乳化稳定性产生一定的影响。乳清蛋白在进行改性后，它的乳化性以及乳化稳定性都降低了。并且通过该图可以得出，反应的温度和反应时间也都是影响乳清蛋白的乳化性及乳化稳定性的重要因素，即反应的温度越高，乳化性及乳化稳定性下降得越明显，并且在较高的温度下，可以用更短的反应时间，达到类似的效果。产生这样结果的原因：（1）、根据Beate Hiller等人之前的研究，产生这样的结果的原因是因为漆酶与乳清蛋白反应是聚合交联反应，乳清蛋白的聚合交联后，分子量提高以及结构展开，从而推迟了界面的吸附和表面变性，使蛋白质的乳化性下降。（2）、高温下，也会引起乳清蛋白的交联聚合。（3）、根据Oluyemisi E. Adelaku 等人之前的研究，可以知道例如：阿魏酸，儿茶素这种酚酸在没有漆酶的存在下也会引起乳清蛋白的聚合。2．3 热稳定性的变化图2-3-1乳清蛋白热稳定性变化图由图2-3-1知，漆酶对乳清蛋白进行改性后，还会对乳清蛋白的热稳定性产生影响，使乳清蛋白的热稳定性降低。并且通过该图可以得出，不同的反应温度和反应时间，乳清蛋白的热稳定性也不同。在较高的反应温度下，乳清蛋白在改性之后，乳化性及乳化稳定性下降得就越明显，并且在较高的温度下，可以用更短的反应时间，达到类似的效果。产生这样结果的原因：（1）、根据Beate Hiller等人之前的研究，产生这样的结果的原因是因为漆酶与乳清蛋白反应是聚合交联反应，乳清蛋白的聚合交联会使蛋白质的热稳定性下降。（2）、高温下，也会引起乳清蛋白的交联聚合。（3）、根据Oluyemisi E. Adelaku 等人之前的研究，可以知道例如：阿魏酸，儿茶素这种酚酸在没有漆酶的存在下也会引起乳清蛋白的聚合。2．4 起泡性及起泡稳定性的变化图2-4-1乳清蛋白的起泡性变化图图2-4-2乳清蛋白起泡稳定性变化图由图2-4-1及2-4-2知，漆酶对乳清蛋白进行改性后，乳清蛋白的乳化性及乳化稳定性会发生变化，即通过漆酶改性之后，使乳清蛋白的起泡性性及起泡稳定性都有了增加。并且通过该图可以得出，温度越高，乳清蛋白的起泡性及起泡稳定性增加得越明显，并且在较高温度下，可以用更短的反应时间，达到类似的效果。产生这样结果的原因：（1）、根据Beate Hiller等人之前的研究，产生这样的结果的原因是因为漆酶与乳清蛋白反应是聚合交联反应，乳清蛋白的聚合交联会使蛋白质的起泡性及起泡稳定性下降。（2）、高温下，也会引起乳清蛋白的交联聚合。（3）、根据Oluyemisi E. Adelaku 等人之前的研究，可以知道例如：阿魏酸，儿茶素这种酚酸在没有漆酶的存在下也会引起乳清蛋白的聚合。2．5 抗氧化能力的变化图2-5-1乳清蛋白DPPH清除率变化图由图2-5-1知，漆酶对乳清蛋白进行改性后，乳清蛋白的抗氧化性会发生一定的变化。在经过漆酶改性之后，乳清蛋白的抗氧化性可以得到很好地提高。且温度越高，乳清蛋白的抗氧化性增加得就越明显，较高温度下，可以用更短的反应时间，达到类似的效果。产生这样结果的原因：（1）、根据Beate Hiller等人之前的研究，产生这样的结果的原因是因为漆酶与乳清蛋白反应是聚合交联反应，乳清蛋白发生交联反应后，三级结构打开，原来埋在结构内具有抗氧化性的氨基酸链暴露，从而乳清蛋白在聚合交联后抗氧化性提高。（2）、高温下，也会引起乳清蛋白的交联聚合。（3）、根据Oluyemisi E. Adelaku 等人之前的研究，可以知道例如：阿魏酸，儿茶素这种酚酸在没有漆酶的存在下也会引起乳清蛋白的聚合。3 讨论 本实验方案前期经过仔细的设计，并且在实验过程中严格按照实验标准规范操作，实验结果标准偏差除溶解性和乳化性略大，其他的比较小，说明重复性好。除此以外本实验结果的变化方向与现有的Beate Hiller等人的研究结果大致相符。所以该实验结果具有一定的可靠性。在并且从实验结果中，可以看到，经过漆酶酶改性之后的乳清蛋白的溶解性、热稳定性、乳化性、乳化稳定性是下降的。但是起泡性、起泡稳定性和抗氧化性这些功能特性是增加的，在如平时的生产应用中，我们可以根据需要，进行选择。而且通过实验结果可以知道在较高温度下，可以用更短的反应时间，达到类似的效果这一特点。所以在生产应用中，为了提高效率，我们可以选择高温。但是由于酶对温度比较敏感，大多数的酶液在较高温度下回失活，所以不可行。但是我们研究的芽孢漆酶在热稳定性方面，具有很好的耐热性，很稳定，能够满足这一条件，所以芽孢漆酶进行乳清蛋白的改性具有很好的应用前景。致谢其次要感谢的是酶工程实验的各位硕士研究生、博士研究生们，感谢他们在实验实施及完成过程中给予我无私帮助和指导，尤其是孙建娜师姐和权威师姐。在此表示最诚挚的谢意。除此以外，我还要感谢我的家人，感谢他们对我的关心和支持，使我的本科学习能够顺利完成。参考文献： [1]蒲玲玲. 乳清蛋白的组成及主要保健功能. 军事医学科学院卫生学环境医学研究所[D], 2011[2]韩雪,孙冰. 乳清蛋白的功能特性及应用. 黑龙江龙丹乳液科技股份有限公司[D], 2003[3] 王红梅, 张永忠. 牛乳清β- 乳球蛋白过敏原非酶改性技术研究进展[D], 2007[4]高金明,葛珊.乳清蛋白改性的研究进展[D], 2009[5]史新慧,王兰.植物蛋白的改性[J].郑州工程学院学报,1996,(12):60一65.[6]刘智宇.植物蛋白的酞化改性及其应用综述[J].商业科技开发,1996(3):14一16·[7]AkioKato,AtsushiTanaka,NaotoshiMatsudomi,etal.DamidationofofodProteinsbyProteaseinal-kalinePH[J].FoodChemistry,1987,(35):224一227.[8]M.Motoki,K.seguro.Transglutaminase and its use for food Proeessing [Jl.Trends in food science & technology,1998,(9):204一210.[9] SodenD.M., DobsonA.D.W. 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目录
摘要 2
关键词 2
Abstract 2
Key words 3
引言 3
1 材料与方法 4
1．1 材料 4
1.1.1菌种 4
1.1.2主要试剂 4
1.1.3培养基 4
1.1.4实验仪器 4
1．2 方法 5
1.2.1漆酶的发酵表达 5
1.2.2漆酶粗酶液的制备及漆酶酶活的测定 5
1.2.3漆酶与乳清蛋白反应 6
1.2.4冷冻干燥 6
1.2.5漆酶与乳清蛋白反应的反应产物指标的测定 6
2 结果与分析 9
2．1 溶解性的变化 9
2．2 乳化性及乳化稳定性的变化 9
2．3 热稳定性的变化 9
2．4 起泡性及起泡稳定性的变化 9
2．5 抗氧化能力的变化 9
3 讨论 10
致谢 10
芽孢漆酶对蛋白加工性能的影响
引言
引言
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072*
atic modification is a promising way to modify whey protein compared with other ways. From the previous studies ,we can know enzymes such as laccase, which have the ability to modify the whey protein modification, can catalyze the oxidation of whey proteins to form a polymer changing its functional properties . And the ability can be greatly improved in the presence of the Catechin. So when we want to enzymaticly modify the whey protein ,we usually add the Catechin to greatly speed up the rate of the reaction. And compared with fungal laccase, Bacillus laccase has a better thermal stability. In order to observe the effect of laccase on protein processing performance,the experiment with Bacillus laccase in the presence of Catechin in a different reaction temperature for the oxidation of whey protein modification has been done. Finally,we can get results : (1)、whey protein modified with laccase has a higher antioxidant（increasing by 13.74%~23.18%, foaming (increasing by 10.91%~23.49%)and foaming stability (increasing by 4.97%~8.77%) and a lower emulsifying(decreasing by 2.22% ~ 13.89%), emulsifying stability (decreasing by 10.62%~49.07%) ,solubility(decreasing by 14.49%~21.17%) and thermal stability (24.22%~66.23%) . （2）、whey protein modified in a higher reaction temperature can get the same results and effectively shorten the time required for the reaction. (3)、whey protein reacts with the Catechin also can get a higher antioxidant, foaming ability and foaming stability and a lower emulsifying, emulsifying stability ,solubility and thermal stability . 牛乳中酪蛋白在沉淀分离时，在上清液中的多种蛋白质组分：β-乳球蛋白、α-乳白蛋白等被统称为乳清蛋白，它的含量大约为牛乳总重量的0.7％[1]。它具有很多的功能特性。（1）、成胶性：乳清蛋白在加热后形成热诱导性的凝胶。成胶作用受温度以及蛋白质的质量分数影响。其中最佳的成胶条件是：温度为70℃-90℃，蛋白质质量分数为10%-20%，酸性条件（pH 4.6-6.0）。（2）、搅打起泡性：搅打起泡性就是，乳清蛋白在形成泡沫的时候，会具有表面活性作用，可以起泡。（3）乳化性：乳清蛋白既含有亲水基团，又含有疏水基团，这一特点使乳清蛋白具有乳化性。（4）涂层性：用乳清蛋白制成可食用性的膜。这种膜可以优化产品的外观、提高产品的稳定性、改善产品的口感以及保护产品的风味和香味。例如当应用在以花生这类坚果作为原料的一些食品中时，它可以很有效地降低产品哈败的速度，使食品体系中的坚果仍然能够保持它的脆性。（5）微胶束化：微胶束化就是利用乳清蛋白它的成膜性能，将挥发性物质进行微胶束化[2]。 但是乳清蛋白也存在一些问题：（1）、是一种常见的过敏原，引起牛乳过敏。其中的β- 乳球蛋白是引起牛乳过敏的主要成分，其次为α- 乳白蛋白[3]。（2）、蛋白质含有氨基和羰基，因此，在在升高温度的时候，它会发生分解缩合，最终缩合成不溶解的褐色产物类黑素，即发生了美拉德反应，会对产品的色泽造成一定的影响。这些问题可以通过乳清蛋白的改性得以解决，并且同时改善乳清蛋白的一些功能特性[4]。 改性的方法有物理改性、化学改性和酶法改性。这些改性方法是通过改变乳清蛋白的分子大小以及氨基酸的组成和顺序、结构、表面静电荷和疏水基团这些方面来达到增强或改善其乳清蛋白功能特性的目的。其中物理改性方法，包括热处理、高压、质构化以及超临界二氧化碳流体处理等[5].化学改性包括：酰化、磺化、磷酸化、糖基化、脱酰胺[6,7]。酶法改性包括：蛋白质聚合交联作用、蛋白质水解作用[8]。 在这些改性方法中，因化学改性和物理改性（非酶法改性）反应简单、应用广泛和效果显著，该方法是目前用的较多的乳清蛋白改性技术。但是该方法也存在着反应条件苛刻，试剂专一性不强，最终产品中除去未反应试剂较困难等一些不足之处。相比非酶法改性，酶法改性具有酶源易得、反应速度快、条件温和、专一性强、成本相对可以接受、应用更安全、可将蛋白质改性到所期望的功能等优点，并且目前国内外很多科研人员都在进行酶法改性的研究，使该法得到了很大的发展。更重要的是，目前，消费者都对具有高营养价值、安全卫生和抗过敏等特点的新型食品给予越来越多的重视，由于酶法在生产过程表现出的反应条件的温和性和副产物少的专一性，因此采用酶技术生产或改造新型食品具有很重要的发展潜力[4] 。除此以外，酶法改性还可以降低牛乳清蛋白的免疫原性，减少婴幼儿的过敏反应[3]。 漆酶( laccase，苯二醇，氧化还原酶，EC1. 10. 3. 2) 是一种含铜多酚氧化酶，它与植物中的抗坏血酸氧化酶(ascorbieacidoxidase)以及哺乳动物中的血浆铜蓝蛋白(ceruloplasmin)是同源的，都是蓝铜氧化酶( bluecopperoxidase) 家族中的一员[9, 10]，可利用分子氧作为电子的受体去氧化多种类型的酚类化合物及一些非酚类的化合物，将分子氧还原为水[11]。漆酶与过氧化物酶和酪氨酸酶共同组成了酚类物质的氧化酶群[12]。 漆酶最早是在1883年被日本学者Yoshida发现的。由于是在日本漆树(Rhus vernicifera)的分泌液中发现的，所以在1894年，Bertrand将其命名为漆酶。大量的研究表明，漆酶广泛地存在于植物、真菌和细菌中，即植物漆酶、真菌漆酶和细菌漆酶[13-15]。 由于真菌漆酶比细菌漆酶更易得到，所以在目前的研究中，对真菌漆酶的研究更多，所以对真菌的结构更清楚，应用的也更多。相比真菌漆酶，细菌漆酶与之结构相似，同样含有4个铜结合位点，但是它们的全序列却是不同的。所以，其反应的条件以及动力学特征就会与真菌漆酶有所不同。其反应速度可能会变慢，因为Cu2+可能成为其中的必要元素。正是由于这些不同之处，细菌漆酶只能被称为“多酚氧化酶”或者“多铜氧化酶”，它也被称为漆酶类似物( lac-case-like)[12]。 然而，细菌漆酶相比真菌漆酶，它存在Cu2+抗性[16]、热稳定性好、不需糖基化[17]以及及酶活性的最适pH值范围更广[18]等优点。同时，相比真菌，细菌生长的代时更短，所需营养成分更简单易得，更便于大规模的培养；除此以外，细菌漆酶对热、卤素和碱的稳定性更好。因此，细菌漆酶的研究对漆酶应用的环境条件以及应用领域的扩展都具有十分重要的意义。并且本实验室在前期，已经通过筛选鉴定在死亡谷芽孢杆菌中发现了漆酶fmb-103，本实验的研究人员通过氮离子束诱变，已经获得了性状优良的突变株fmb-820，并且通过优化菌株fmb-820发酵条件，已经获得了其高产的条件，为漆酶的大规模生产以及它的应用都提供了基础。经过优化的重组漆酶发酵条件为：葡萄糖：0.0200g/50mL，酵母提取物：0.5200g/50mL，Cu2+：14.5400mmol/50mL[19]。1 材料与方法 1．1 材料1.1.1菌种由本学院酶工程实验室保藏的菌株fmb-820。1.1.2主要试剂 2, 2’-连氮-二(3-乙基苯并噻唑-6-磺酸)(ABTS) （Sigma公司产品）；氨苄青霉素（Amresco公司产品）；胰蛋白胨和酵母粉（Oxoid公司生产）；乳清蛋白（北京赢力康源国际贸易有限公司）；DPPH(梯希爱化成工业发展有限公司);其它常规试剂均为分析纯1.1.3培养基 LB培养基:10g 胰蛋白胨；10g NaCl；5g 酵母粉；1000 mL 蒸馏水。1.1.4实验仪器 SW-CJ-1FD型单人单面净化工作台： 苏州净化设备有限公司 培英HYL-A全温摇瓶柜： 太仓实验设备厂 UV-2450紫外可见分光光度计： 日本岛津公司 5804 R 高速冷冻离心机： Eppendorf 德国基因公司 JY91-ⅡDN超声波破碎仪： 宁波新芝生物科技股份有限公司1．2 方法1.2.1漆酶的发酵表达 发酵培养主要包括:(1)、种子液的培养、(2)、发酵液的培养（3）、发酵完成后需要对菌液进行离心、破碎等一些操作得到粗酶液（4）、85℃加热离心得到初步纯化的酶液（5）、在85℃测定酶活。种子液培养 将转导有解淀粉芽孢杆菌漆酶基因的大肠杆菌置于-70℃、50%甘油保存。在进行种子液培养时，以千分之一的接种量进行接种即20mL LB培养基中加入20μL甘油保存的菌种，与此同时加入10μL 浓度为200mg/mL氨苄青霉素，在37℃、180rpm条件下进行隔夜摇床培养。发酵液培养 仍然使用LB培养基为发酵液，以千分之一的接种量将种子液接种，50ml发酵液中加入50μL长好的种子液，同时加入200mg/mL氨苄青霉素25μL，37℃、180rpm摇床培养。 生长检测当发酵液菌体浓度达到OD600=0.6的时候进行诱导，通常37℃、180rpm摇床达到0.6吸光值需要3~4h。诱导时，无菌操作下在发酵液中加入25μL 200mg/mL氨苄青霉素和500μL 25mmol.L-1CuSO4 。然后将发酵液置于16℃、180rpm的条件下进行诱导表达，时间为6h。1.2.2漆酶的粗酶液的制备及漆酶的酶活的测定 漆酶在大肠杆菌中是以胞内酶的形式表达的，所以在提取漆酶粗酶液时候需要经过下面的一系列操作，具体操作如下： 取50mL的发酵液用离心机以转速8000rpm进行离心10min，弃上清液、收集菌体，再加入10ml 细胞裂解液（ pH=7.0 PBS磷酸缓冲液）进行菌体重悬。并用移液枪进行吹打，直至均匀。在吹打均匀之后，用超声破碎机进行超声破碎菌体（40w，超声1s，停顿2s，共超声30min）。在超声破碎结束后，用离心机（4℃、9000rpm）离心10min，收集上清液即为粗酶液。 利用芽孢漆酶高热稳定性，在85℃的高温下，其他酶都失活的情况下该酶仍然具有很高的酶活力这一特点。进行酶液的85℃的加热，来进行粗酶液的初步纯化，并且进行离心。得到上清液即为初步纯化的漆酶酶液。 在得到初步纯化的漆酶酶液之后，采用 Shin & Lee（2000）的 ABTS法，并稍作改动进行酶活的测定：先后加入2.45mL柠檬酸-磷酸盐缓冲液（ 0.2mol/L； pH 5.0）、 0.5mL ABTS（ 6mmol/L） 以及50μL用缓冲液适当稀释的漆酶初步纯化的酶液，在85℃下，以灭活的酶液做空白对照，测定反应的前 3min内，反应液在 420nm 处吸光值（OD)的增加量。每分钟内生成 1μmol 反应物所需的酶量即为一个酶活力单位。漆酶酶活计算公式：漆酶活力（U）=V总×ΔOD / ( V酶 ×ε×Δt× 10-6 )×总酶酶液稀释倍数；其中：ε=3.6 × 104mol/cm；Δt：3min；ΔOD：3min 内吸光度OD 的变化值；V总：反应中，反应液的总体积,3ml；V酶：酶反应中，酶液的体积,50μl。实验重复3次，取平均值。1.2.3漆酶与乳清蛋白反应 漆酶与乳清蛋白按照表1-1的条件进行反应。组号WPI/gEnzyme/U/mg milk proteinpHT/℃Catechin umol/mg milk protein反应时间/min未处理4.2127.4A4.2120.117.4800.0860B4.2120.117.4600.0860C4.2120.117.4400.0860D4.2120.117.4800.0830E4.2120.117.4600.0830F4.2120.117.4400.0830G4.2127.4800.0860H4.2127.4600.0860I4.2127.4400.0860J4.2127.4800.0830K4.2127.4600.0830L4.2127.4400.0830表1-1：芽孢漆酶与乳清蛋白反应条件表1.2.4冷冻干燥 将按表1-1反应条件进行乳清蛋白改性后得到的改性乳清蛋白的溶液—进行装盘，封上保鲜膜—用牙签戳出小孔—20℃冷冻一夜—然后放置于真空冷冻的干燥仓中—冻结到终温为-35℃—维持在-40℃左右进行升华干燥—温度设置在40"C进行解吸—出料，包装—最终就获得了改性的乳清蛋白粉。1.2.5漆酶与乳清蛋白反应的反应产物指标的测定 将上述改性的乳清蛋白粉进行以下指标的测定，以空白组作为对照。1.2.5.1热稳定性的测定 配制蛋白溶液（w/w=5%)，然后取5ml该蛋白质溶液置于玻璃试管中，用油浴锅设置温度140℃进行加热，记录开始加热到发生凝结所需的时间t，单位：s。1.2.5.2乳化性及乳化稳定性的测定 参考Pearce和Kinsella l978年提出的蛋白质乳化性的测定方法，并稍作改动，进行改性乳清蛋白的乳化性及乳化稳定性：（1）、样品的乳化：准确称取0．01 g样品—用柠檬酸一磷酸氢二钠缓冲液（pH 7）进行溶解并定容至10 mL—取3 mL该蛋白质溶液于塑料离心管中—然后加入1 mL花生油—之后以13 500 r／min的转速离心1min，进行改性乳清蛋白的乳化。（2）、吸光度的测定：在乳化之后立即从离心管底部吸取0．1ml乳浊液—加入SDS溶液（质量分数0．1％）进行稀释，稀释100倍—然后在直径1 cm的比色皿中在500 nm条件下测定其吸光值—经过30 min后，从离心管的底部再次吸取0．1 rnL乳浊液，进行第二次吸光值的测定。其中蛋白的乳化性用吸光度表示，蛋白的乳化稳定性(Es)为:Es=A0 T/(A0-At) 式中：Es为乳化稳定性(min)；T为两次测定乳化性的时间间隔(min)；A0为乳化之后第1次测定的乳浊液的吸光度值；At为30min后，第2次测定乳浊液的吸光度值。1.2.5.3起泡性的测定 准确称取乳清蛋白或改性乳清蛋白0．5 g，将其溶于50 mL 0．05 mol·L_1Tris—HCI缓冲液(pH 7．5)中，将其配制成一定浓度(1％)的溶液。取2 mL乳清蛋白-Tris-HCl溶液或改性乳清蛋白-Tris-HCl溶液，置于10 mL量筒中，进行上下震荡（l min），记录下0 min时的初始泡沫的体积，记为H0，然后静置10min后，再测量终止泡沫体积，记为H10。其中起泡性大小以H0作为评价的指标，起泡稳定性的大小则以H0/H10作为评价的指标。1.2.5.4溶解性的测定 利用双缩脲法，进行改性乳清蛋白的溶解性的测定。 (1)乳清蛋白标准溶液的配制：准确称取已经进行过微量凯式定氮测定的乳清蛋白，用NaOH溶液（0．05 mol／L）配制成标准溶液（蛋白质质量浓度为10g/L的）。 (2)标准曲线的测定：取12支试管分成2组，一组测定，一组平行。在每一组的6支试管中分别加入0ml，0．2ml，0．4ml，0．6ml，0．8ml，1．0 mL配制好的标准乳清蛋白溶液，然后用水补足到2 mL，各加入6.3ml双缩脲试剂(6mlA液+300μl的B液），并充分摇匀，然后在室温下，放置30 min，再于波长540 nm处进行比色测定，测定其吸光度值。取两组平均值，绘制标准曲线。 (3)改性乳清蛋白的溶解性大小的测定：准确称取0．5 g漆酶改性的乳清蛋白于80 mlL烧杯中．缓慢加入40ml的去离子水，然后将烧杯放在磁力搅拌器上进行搅拌，使漆酶改性的乳清蛋白充分地溶解（搅拌的速度以刚好不在溶液表面形成漩涡为宜）。搅拌1 h（在搅拌的过程中，用HCl溶液或NaOH溶液调节pH值），之后将溶液定容至50 mL。于4 000 r／min离心，离心时间为30 min。然后同样用双缩脲法测定漆酶改性的乳清蛋白的吸光度值，代入吸光度-乳清蛋白蛋白质含量的标准曲线，确定漆酶改性的乳清蛋白的浓度。然后代入公式，计算出蛋白质溶解性。蛋白质的溶解性为：漆酶改性的乳清蛋白蛋白质溶解性（%）=上清液中蛋白质的质量浓度（g/l) * 50 * 100 样品质量（mg) *样品蛋白质质量分数（%） 1001.2.5.5抗氧化性的测定参照saiga的方法，并略作修改，进行漆酶改性乳清蛋白的抗氧化性的测定。将样品配成20 g／L的质量浓度。取1．0 mL的样品液、4．0 mL浓度为0．1 mmol／L 的DPPH乙醇溶液(体积分数为95％)，混合均匀，在室温下避光反应30 min。用体积分数为95％的乙醇溶液作为参比。于波长517 nm处测定吸光度值。然后将吸光度值代入下面公式中，通过计算可以得到每种处理得到的改性乳清蛋白对DPPH自由基的清除率大小： DPPH清除率=(1一(Ai-Aj)) ×100 Ac该式中：Ai，为加入改性乳清蛋白样品液后的DpPH溶液的吸光度值；Aj为样品液的吸光值；Ac，为未加改性乳清蛋白样品液时的DPPH溶液的吸光度值。2 结果与分析 2．1 溶解性的变化图1-2-1蛋白质浓度的标准曲线图1-2-2乳清蛋白的溶解性变化图由图1-2-2可知，漆酶对乳清蛋白进行改性后，乳清蛋白的溶解性发生了明显的变化，即改性之后的乳清蛋白的溶解性有所下降。除此以外，通过该图还可以看到，加了儿茶素的比不加儿茶素的溶解性也有所下降。而且反应的温度和反应的时间也会影响乳清蛋白的溶解性的大小，即温度越高，改性乳清蛋白的溶解性下降得就越明显。并且在较高的温度下，可以用更短的反应时间，达到类似的效果。产生这样结果的原因：（1）、根据Beate Hiller等人之前的研究，产生这样的结果的原因是因为漆酶与乳清蛋白反应是聚合交联反应。在聚合交联反应之后，二硫键被氧化，乳清蛋白的结构就变得更不紧凑了，二级、三级结构暴露，从而使蛋白质的溶解性下降。（2）、高温下，也会引起乳清蛋白的交联聚合。（3）、根据Oluyemisi E. Adelaku 等人之前的研究，可以知道例如：阿魏酸，儿茶素这种酚酸在没有漆酶的存在下也会引起乳清蛋白的聚合。 2．2 乳化性及乳化稳定性的变化图2-2-1乳清蛋白乳化性变化图图2-2-2乳清蛋白乳化稳定性变化图由图2-2-1及2-2-2可以知道，漆酶对乳清蛋白进行改性后，会对乳清蛋白的乳化性以及乳化稳定性产生一定的影响。乳清蛋白在进行改性后，它的乳化性以及乳化稳定性都降低了。并且通过该图可以得出，反应的温度和反应时间也都是影响乳清蛋白的乳化性及乳化稳定性的重要因素，即反应的温度越高，乳化性及乳化稳定性下降得越明显，并且在较高的温度下，可以用更短的反应时间，达到类似的效果。产生这样结果的原因：（1）、根据Beate Hiller等人之前的研究，产生这样的结果的原因是因为漆酶与乳清蛋白反应是聚合交联反应，乳清蛋白的聚合交联后，分子量提高以及结构展开，从而推迟了界面的吸附和表面变性，使蛋白质的乳化性下降。（2）、高温下，也会引起乳清蛋白的交联聚合。（3）、根据Oluyemisi E. Adelaku 等人之前的研究，可以知道例如：阿魏酸，儿茶素这种酚酸在没有漆酶的存在下也会引起乳清蛋白的聚合。2．3 热稳定性的变化图2-3-1乳清蛋白热稳定性变化图由图2-3-1知，漆酶对乳清蛋白进行改性后，还会对乳清蛋白的热稳定性产生影响，使乳清蛋白的热稳定性降低。并且通过该图可以得出，不同的反应温度和反应时间，乳清蛋白的热稳定性也不同。在较高的反应温度下，乳清蛋白在改性之后，乳化性及乳化稳定性下降得就越明显，并且在较高的温度下，可以用更短的反应时间，达到类似的效果。产生这样结果的原因：（1）、根据Beate Hiller等人之前的研究，产生这样的结果的原因是因为漆酶与乳清蛋白反应是聚合交联反应，乳清蛋白的聚合交联会使蛋白质的热稳定性下降。（2）、高温下，也会引起乳清蛋白的交联聚合。（3）、根据Oluyemisi E. Adelaku 等人之前的研究，可以知道例如：阿魏酸，儿茶素这种酚酸在没有漆酶的存在下也会引起乳清蛋白的聚合。2．4 起泡性及起泡稳定性的变化图2-4-1乳清蛋白的起泡性变化图图2-4-2乳清蛋白起泡稳定性变化图由图2-4-1及2-4-2知，漆酶对乳清蛋白进行改性后，乳清蛋白的乳化性及乳化稳定性会发生变化，即通过漆酶改性之后，使乳清蛋白的起泡性性及起泡稳定性都有了增加。并且通过该图可以得出，温度越高，乳清蛋白的起泡性及起泡稳定性增加得越明显，并且在较高温度下，可以用更短的反应时间，达到类似的效果。产生这样结果的原因：（1）、根据Beate Hiller等人之前的研究，产生这样的结果的原因是因为漆酶与乳清蛋白反应是聚合交联反应，乳清蛋白的聚合交联会使蛋白质的起泡性及起泡稳定性下降。（2）、高温下，也会引起乳清蛋白的交联聚合。（3）、根据Oluyemisi E. Adelaku 等人之前的研究，可以知道例如：阿魏酸，儿茶素这种酚酸在没有漆酶的存在下也会引起乳清蛋白的聚合。2．5 抗氧化能力的变化图2-5-1乳清蛋白DPPH清除率变化图由图2-5-1知，漆酶对乳清蛋白进行改性后，乳清蛋白的抗氧化性会发生一定的变化。在经过漆酶改性之后，乳清蛋白的抗氧化性可以得到很好地提高。且温度越高，乳清蛋白的抗氧化性增加得就越明显，较高温度下，可以用更短的反应时间，达到类似的效果。产生这样结果的原因：（1）、根据Beate Hiller等人之前的研究，产生这样的结果的原因是因为漆酶与乳清蛋白反应是聚合交联反应，乳清蛋白发生交联反应后，三级结构打开，原来埋在结构内具有抗氧化性的氨基酸链暴露，从而乳清蛋白在聚合交联后抗氧化性提高。（2）、高温下，也会引起乳清蛋白的交联聚合。（3）、根据Oluyemisi E. Adelaku 等人之前的研究，可以知道例如：阿魏酸，儿茶素这种酚酸在没有漆酶的存在下也会引起乳清蛋白的聚合。3 讨论 本实验方案前期经过仔细的设计，并且在实验过程中严格按照实验标准规范操作，实验结果标准偏差除溶解性和乳化性略大，其他的比较小，说明重复性好。除此以外本实验结果的变化方向与现有的Beate Hiller等人的研究结果大致相符。所以该实验结果具有一定的可靠性。在并且从实验结果中，可以看到，经过漆酶酶改性之后的乳清蛋白的溶解性、热稳定性、乳化性、乳化稳定性是下降的。但是起泡性、起泡稳定性和抗氧化性这些功能特性是增加的，在如平时的生产应用中，我们可以根据需要，进行选择。而且通过实验结果可以知道在较高温度下，可以用更短的反应时间，达到类似的效果这一特点。所以在生产应用中，为了提高效率，我们可以选择高温。但是由于酶对温度比较敏感，大多数的酶液在较高温度下回失活，所以不可行。但是我们研究的芽孢漆酶在热稳定性方面，具有很好的耐热性，很稳定，能够满足这一条件，所以芽孢漆酶进行乳清蛋白的改性具有很好的应用前景。致谢其次要感谢的是酶工程实验的各位硕士研究生、博士研究生们，感谢他们在实验实施及完成过程中给予我无私帮助和指导，尤其是孙建娜师姐和权威师姐。在此表示最诚挚的谢意。除此以外，我还要感谢我的家人，感谢他们对我的关心和支持，使我的本科学习能够顺利完成。参考文献： [1]蒲玲玲. 乳清蛋白的组成及主要保健功能. 军事医学科学院卫生学环境医学研究所[D], 2011[2]韩雪,孙冰. 乳清蛋白的功能特性及应用. 黑龙江龙丹乳液科技股份有限公司[D], 2003[3] 王红梅, 张永忠. 牛乳清β- 乳球蛋白过敏原非酶改性技术研究进展[D], 2007[4]高金明,葛珊.乳清蛋白改性的研究进展[D], 2009[5]史新慧,王兰.植物蛋白的改性[J].郑州工程学院学报,1996,(12):60一65.[6]刘智宇.植物蛋白的酞化改性及其应用综述[J].商业科技开发,1996(3):14一16·[7]AkioKato,AtsushiTanaka,NaotoshiMatsudomi,etal.DamidationofofodProteinsbyProteaseinal-kalinePH[J].FoodChemistry,1987,(35):224一227.[8]M.Motoki,K.seguro.Transglutaminase and its use for food Proeessing [Jl.Trends in food science & technology,1998,(9):204一210.[9] SodenD.M., DobsonA.D.W. 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目录
摘要 2
关键词 2
Abstract 2
Key words 3
引言 3
1 材料与方法 4
1．1 材料 4
1.1.1菌种 4
1.1.2主要试剂 4
1.1.3培养基 4
1.1.4实验仪器 4
1．2 方法 5
1.2.1漆酶的发酵表达 5
1.2.2漆酶粗酶液的制备及漆酶酶活的测定 5
1.2.3漆酶与乳清蛋白反应 6
1.2.4冷冻干燥 6
1.2.5漆酶与乳清蛋白反应的反应产物指标的测定 6
2 结果与分析 9
2．1 溶解性的变化 9
2．2 乳化性及乳化稳定性的变化 9
2．3 热稳定性的变化 9
2．4 起泡性及起泡稳定性的变化 9
2．5 抗氧化能力的变化 9
3 讨论 10
致谢 10
芽孢漆酶对蛋白加工性能的影响
引言
引言
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