一种肉物种鉴别方法设计
人类健康与肉类食品的摄入密不可分。目前国内外肉类食品掺假问题屡见不鲜，受到了公众和媒体的广泛关注，肉类掺假检验技术的研发已逐渐成为热点。本项目旨在研究一种基于蛋白质分析的动物源性定量分析技术，通过高效液相色谱质谱联用分析特异性的氨基酸序列，准确甄别样本中的肉源性组成，采用绝对定量或相对定量的方法分析得到样品中5种动物肌肉的准确含量，建立了一种基于Nano LC和LTQ-Orbitrap XL的肉类溯源性检测鉴别方法，进而达到辨别摻伪肉质加工品的目的。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1材料与方法2
1.1材料、试剂、设备与仪器 2
1.2 特征多肽筛选方法3
1.3特征多肽验证方法4
2 结果与分析5
2.1 Bca试剂盒标准品标准曲线5
2.2 肌肉全蛋白溶液浓度表5
2.3 肌肉全蛋白溶液 Nanodrop定量肽段含量表6
2.4NCBI数据库检索结果6
2.5 肌肉全蛋白溶液消化后产物特种多肽分析结果7
3 讨论 9
4 展望9
致谢10
参考文献10
附件1 NCBI数据库：查询序列11
一种肉物种鉴别方法设计
引言
引言
肉类食品含有充足的蛋白质、矿物质和维生素等多种营养素，是人类保持健康不可或缺的重要营养来源。近几十年来，肉类食品在居民消费中的比例逐年上升，然而目前中国肉类食品的安全状况着实令人担忧。以价格低廉的猪肉、鸭肉甚至鼠肉、其它病死动物肉类及过期肉冒充高价牛、羊肉时有曝光，让人触目惊心[1]。
年前，我国部分地区开展了肉类食品的掺假情况调查[2]，调查发现有25.6%的肉类样品与商品标识不符，肉制品掺假情况比较严重，熟制牛肉和食用羊肉卷掺假尤为普遍。调查显示，肉制品的掺假主要表现在：①原料肉类掺假；②肉组织的替换，比如使用其他动物的组织替换肌肉组织成分；③非肉成分的添加，比如刻意注水以及掺入植物蛋白等[3]。这些问题严重影响了世界范围内的肉品产业， *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072^
不但制约了肉品质量的提升，还严重损害了消费者的经济利益和身体健康，甚至造成了一些宗教层面的问题。
早期，对肉类的鉴别方法主要是靠感官判断和形态学的检验，但其检验的局限性比较大，不太适合用于肉类及其加工产品的鉴别[4]。目前国际上对肉类掺假检验方法的研究，已经基本确立了以特征性的脂肪、蛋白质以及核酸等物质作为靶标物进行肉类掺假检验检测的基本思路[5]，其主要的检验技术包括：物理方法、化学技术、DNA鉴定技术、免疫学技术、电泳技术等多种现代化检验技术[68]:物理检测方法一般是通过辨别每个畜体的胴体解剖差异，以肌肉和脂肪的外观、颜色、气味、质地和味道等为肉类的品种和品质鉴定提供一个初步的判断依据[9];化学技术是根据不同物种肉类之间的差异性，检测出肉类的品种[10];以核酸为标志物的动物种类鉴别检测方法，常用的技术有核酸杂交、聚合酶链式反应及其多种衍生方法、DNA条码及新兴的数字PCR技术等 [11];免疫学技术是基于非常特殊的抗原抗体间的相互作用，可以检出并确定复杂混合物如肉品提取物中特定的分析 [12];此外，血清学的和电泳的方法已被确认是可以区分原料肉的种类的方法。电泳方法专注于分离和染色特定的蛋白质，但由于蛋白质的变性，难以分析经过热处理的肉类样品[13]。
然而，目前检测标准体系中现有的动物源性检测手段都只能做到定性或半定量，无法判断摻伪的严重程度，不能严厉打击假冒伪劣的不法商贩[14]。本课题的研究方法致力于提供一种较快速、准确、经济、实用的定量分析技术，不仅适用于生鲜肉，也适用于添加了大量添加剂的深加工熟肉制品，可以用于实际样品批量测试。项目检测方法若能在市面上得到广泛推广,对于我国乃至世界肉类食品市场想必都能起到良好规范作用，沉重打击肉类食品非法掺假的不良商贩，推动社会进步。
材料与方法
1.1材料、试剂、设备与仪器
鸡鸭猪牛羊 生鲜肉若干（特征多肽筛选阶段样品为市面上各大超市购买，20℃冰箱保存，特征多肽验证阶段样品为南京市食品药品监督检察院扩项样品）
2%SDSPBS缓冲液（二水磷酸二氢钠 0.624g，十二水磷酸氢二钠 2.148g， SDS 20g，水 1L，70℃搅拌至澄清）
BCA蛋白定量试剂盒：购于Thermo Scientific（美国）公司，货号：23225
Ultracel3超滤管，每管处理量0.5 mL，截留分子量≥10 kDa
Trypsin 酶 (0.1ug/ul,200ul buffer加入到酶的玻璃瓶中，酶活力≥1645 units/mg，购于SigmaAldrich（美国）公司，货号：T7409)
ZipTip C18枪头（ZTC18S096）购自Millipore（美国）公司
Seppak plus C18柱（360mg吸附剂质量，粒径55105um，孔径125A）
DTT（二硫苏糖醇），IAM（碘乙酰胺），NH4HCO3 ，乙腈， 甲酸 ，
尿素， 硫脲， Tris （三氨基甲烷），盐酸
T25匀浆机
德国IKA公司
CPA2245T25天平
德国Sartorius公司
Avanti JC高速冷冻离心机
美国Beckman Coulter公司
M2多功能酶标仪
美国Molecular Devices公司
Nano LCLTQOrbitrap XL MS/MS
纳升级液相色谱串联质谱仪器
美国Thermo Fisher公司
1.2 特征多肽筛选方法
1.2.1全蛋白提取
取2g肉样（去除结缔组织和脂肪），切碎，加入30ml2%SDSPBS缓冲液，冰浴条件下匀浆9600rpm 30s 2次然后13400rpm 30s，每次匀浆间隔30s，然后4000g，4℃离心 10min后，上清液用纱布过滤，去除少量不溶成分，即为肌肉全蛋白溶液。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1材料与方法2
1.1材料、试剂、设备与仪器 2
1.2 特征多肽筛选方法3
1.3特征多肽验证方法4
2 结果与分析5
2.1 Bca试剂盒标准品标准曲线5
2.2 肌肉全蛋白溶液浓度表5
2.3 肌肉全蛋白溶液 Nanodrop定量肽段含量表6
2.4NCBI数据库检索结果6
2.5 肌肉全蛋白溶液消化后产物特种多肽分析结果7
3 讨论 9
4 展望9
致谢10
参考文献10
附件1 NCBI数据库：查询序列11
一种肉物种鉴别方法设计
引言
引言
肉类食品含有充足的蛋白质、矿物质和维生素等多种营养素，是人类保持健康不可或缺的重要营养来源。近几十年来，肉类食品在居民消费中的比例逐年上升，然而目前中国肉类食品的安全状况着实令人担忧。以价格低廉的猪肉、鸭肉甚至鼠肉、其它病死动物肉类及过期肉冒充高价牛、羊肉时有曝光，让人触目惊心[1]。
年前，我国部分地区开展了肉类食品的掺假情况调查[2]，调查发现有25.6%的肉类样品与商品标识不符，肉制品掺假情况比较严重，熟制牛肉和食用羊肉卷掺假尤为普遍。调查显示，肉制品的掺假主要表现在：①原料肉类掺假；②肉组织的替换，比如使用其他动物的组织替换肌肉组织成分；③非肉成分的添加，比如刻意注水以及掺入植物蛋白等[3]。这些问题严重影响了世界范围内的肉品产业， *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072^
不但制约了肉品质量的提升，还严重损害了消费者的经济利益和身体健康，甚至造成了一些宗教层面的问题。
早期，对肉类的鉴别方法主要是靠感官判断和形态学的检验，但其检验的局限性比较大，不太适合用于肉类及其加工产品的鉴别[4]。目前国际上对肉类掺假检验方法的研究，已经基本确立了以特征性的脂肪、蛋白质以及核酸等物质作为靶标物进行肉类掺假检验检测的基本思路[5]，其主要的检验技术包括：物理方法、化学技术、DNA鉴定技术、免疫学技术、电泳技术等多种现代化检验技术[68]:物理检测方法一般是通过辨别每个畜体的胴体解剖差异，以肌肉和脂肪的外观、颜色、气味、质地和味道等为肉类的品种和品质鉴定提供一个初步的判断依据[9];化学技术是根据不同物种肉类之间的差异性，检测出肉类的品种[10];以核酸为标志物的动物种类鉴别检测方法，常用的技术有核酸杂交、聚合酶链式反应及其多种衍生方法、DNA条码及新兴的数字PCR技术等 [11];免疫学技术是基于非常特殊的抗原抗体间的相互作用，可以检出并确定复杂混合物如肉品提取物中特定的分析 [12];此外，血清学的和电泳的方法已被确认是可以区分原料肉的种类的方法。电泳方法专注于分离和染色特定的蛋白质，但由于蛋白质的变性，难以分析经过热处理的肉类样品[13]。
然而，目前检测标准体系中现有的动物源性检测手段都只能做到定性或半定量，无法判断摻伪的严重程度，不能严厉打击假冒伪劣的不法商贩[14]。本课题的研究方法致力于提供一种较快速、准确、经济、实用的定量分析技术，不仅适用于生鲜肉，也适用于添加了大量添加剂的深加工熟肉制品，可以用于实际样品批量测试。项目检测方法若能在市面上得到广泛推广,对于我国乃至世界肉类食品市场想必都能起到良好规范作用，沉重打击肉类食品非法掺假的不良商贩，推动社会进步。
材料与方法
1.1材料、试剂、设备与仪器
鸡鸭猪牛羊 生鲜肉若干（特征多肽筛选阶段样品为市面上各大超市购买，20℃冰箱保存，特征多肽验证阶段样品为南京市食品药品监督检察院扩项样品）
2%SDSPBS缓冲液（二水磷酸二氢钠 0.624g，十二水磷酸氢二钠 2.148g， SDS 20g，水 1L，70℃搅拌至澄清）
BCA蛋白定量试剂盒：购于Thermo Scientific（美国）公司，货号：23225
Ultracel3超滤管，每管处理量0.5 mL，截留分子量≥10 kDa
Trypsin 酶 (0.1ug/ul,200ul buffer加入到酶的玻璃瓶中，酶活力≥1645 units/mg，购于SigmaAldrich（美国）公司，货号：T7409)
ZipTip C18枪头（ZTC18S096）购自Millipore（美国）公司
Seppak plus C18柱（360mg吸附剂质量，粒径55105um，孔径125A）
DTT（二硫苏糖醇），IAM（碘乙酰胺），NH4HCO3 ，乙腈， 甲酸 ，
尿素， 硫脲， Tris （三氨基甲烷），盐酸
T25匀浆机
德国IKA公司
CPA2245T25天平
德国Sartorius公司
Avanti JC高速冷冻离心机
美国Beckman Coulter公司
M2多功能酶标仪
美国Molecular Devices公司
Nano LCLTQOrbitrap XL MS/MS
纳升级液相色谱串联质谱仪器
美国Thermo Fisher公司
1.2 特征多肽筛选方法
1.2.1全蛋白提取
取2g肉样（去除结缔组织和脂肪），切碎，加入30ml2%SDSPBS缓冲液，冰浴条件下匀浆9600rpm 30s 2次然后13400rpm 30s，每次匀浆间隔30s，然后4000g，4℃离心 10min后，上清液用纱布过滤，去除少量不溶成分，即为肌肉全蛋白溶液。
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