一株分离于香肠中的芽孢杆菌鉴定及特性研究
一株分离于香肠中的芽孢杆菌鉴定及特性研究[20200408174154]
摘 要
芽孢杆菌对外界有害因子抵抗力很强，一般食品中产芽孢的细菌具有很强的耐热和耐压能力，是造成食品腐败变质的主要原因。所以，杀灭食品中的芽孢杆菌是目前食品杀菌工序的最大难题。本文从家庭自制香肠中分离筛选出一株耐热芽孢杆菌，通过生理生化实验和分子生物学技术进行鉴定，并对其该菌株纯培养液的灭菌条件进行研究。实验结果表明，此菌株的16S rDNA的序列与菌株甲基营养型芽孢杆菌Bacillus methylotrophicus的同源性高达98.89%，通过形态学和生理生化试验结果分析，鉴定菌株为甲基营养型芽孢杆菌Bacillus methylotrophicus。.
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关键字:芽孢杆菌香肠16SrDNA灭菌
目录
1. 引言1
1.1 芽孢杆菌的分类1
1.2 芽孢杆菌的应用1
1.2.1 芽孢杆菌在工业上的应用1
1.2.2 芽孢杆菌在农业业上的应1
1.2.3 芽孢杆菌在医学上的应用2
1.3 芽孢杆菌的危害2
2. 材料及方法3
2.1 材料3
2.1.1 样品3
2.1.2 试剂及仪器3
2.1.3 培养基3
2.2 实验方法3
2.2.1 菌种活化及分离 3
2.2.2 形态学鉴定3
2.2.3 生理生化试验4
2.2.4 16S rRNA序列分析5
2.2.5种子液制备6
2.2.6灭菌方法对芽孢杆菌的影响6
2.2.7菌落计数7
3. 结果及分析7
3.1 形态学鉴定结果7
3.2 生理生化试验结果8
3. 3 16S rRNA 序列鉴定9
3.3.1 PCR扩增结果.... 9
3.3.2 甲基营养型芽孢杆菌系统发育分析. 10
3. 4 灭菌方法对芽孢杆菌的影响 11
4. 小结 13
参考文献14
附录 .16
致谢17
1 前言
1.1 芽孢杆菌的分类
芽孢杆菌是在一定条件下可以形成芽孢的一类杆菌，包括多个菌属[1]，芽孢杆菌对外界有害因子抵抗力强，并且分布很广，在空气中、土壤中、水源以及动物肠道等处普遍存在[2]，由于芽孢杆菌具有很强的抗逆性，因此能忍受多种不良环境，是整个生物界抗逆性最强的生命体[ 3]，用一般的灭菌方法，如煮沸灭菌法很难将芽孢杆菌完全杀灭[ 4]。
二十世纪70年代和80年代，随着分子分类方法的的应用，越来越多的微生物被发现，被分离鉴定的芽孢杆菌菌种数量增加，分类地位确定的也越来越准确[5-7]。国外芽孢杆菌研究领域较为广泛，这一点我们可从《伯杰氏细菌鉴定手册》中看出。作为微生物分类领域比较著名的分类系统，《伯杰氏细菌鉴定手册》从1923年至今已出版9版，对芽孢杆菌的分类也逐步全面，芽孢杆菌属的物种数目归纳如下：第一版，发表于1923年，第二版，发表于1925年，这两版均把芽孢杆菌分为75种菌；第三版和第四版把芽孢杆菌分为93种菌，其中第三版发表于1930年，第四版发表于1934年；第五版发表于1939年，共记述146株芽孢杆菌； 第六版发表于1948年，共记述33株芽孢杆菌；第七版发表于1957年，共计25株芽孢杆菌；第八版发表于1974年，共计22株芽孢杆菌； 第九版，发表于1984年，根据《伯杰氏细菌鉴定手册》将芽孢杆菌分为4个大类 ，35个种群[8-11] 。
1.2 芽孢杆菌的应用[12]
1.2.1 芽孢杆菌在工业上的应用
芽孢杆菌具有很强的抑菌功能，可以通过占据有效空间位置，以此来抑制其他微生物的生长繁殖，可以作为一种有效地抑菌剂； 芽孢杆菌可以通过降解产生恶臭气味的有机物质除去臭味，很好的改善周围的环境；试验表明，芽孢杆菌能产生多种消化酶，在提高多种动物生产性能方面起着重要作用；芽孢杆菌具有丰富的酶活性，芽孢杆菌所含有的酶能够降解植物饲料细胞的细胞壁，使细胞中的营养成分得以释放出来,并能除去饲料中的一部分抗营养因子，防止吸收的障碍。
1.2.2 芽孢杆菌在农业上的应用
芽孢杆菌在农业领域发挥着强大的功能，广泛应用于农作物肥料，农药的生产。从土壤中分离的芽孢杆菌具有很强的固氮能力，可以有效应用于氮肥的生产，由于芽孢具有很强的抗逆性，解决了氮肥容易污染变质或失水干燥的难题，从而既保证了氮肥的品质又延长了储存时间。另外芽孢杆菌的保湿能力很强，形成的天然材料聚麸胺酸具有良好的塑性和较高的强度 ，可以防止土壤中的水分和矿质元素的流失；芽孢杆菌是一种有机质分解能力很强的微生物，分解有机质的同时，释放出活性很高的酶，将一些难降解的大分子物质降解成可以利用的小分子物质；芽孢杆菌可以产生充足的的次级代谢物，合成多种生理活性物质。
1.2.3 芽孢杆菌在医学上的应用
芽孢杆菌在医学上主要是用于生产活菌制剂，目前芽孢杆菌生产的活菌制剂主要作为口服液用于治疗肠炎、支气管炎等多种疾病[13]。
1.3 芽孢杆菌的危害
芽孢的对人类的最大弊端是芽孢杆菌对外界有害因子抵抗力强，因此在利用加热法储存食品时，芽孢往往造成储存的失败，此外，芽孢杆菌萌发后形成的营养细胞可大量繁殖，是导致食品腐败变质的又一因素。因此以是否杀死芽孢可作为食品灭菌的重要指标[14-15]。所以，杀灭食品中的芽孢杆菌是目前食品杀菌工序的最大难题。而传统的热杀菌技术在杀灭芽孢杆菌的前提下，对食品的色，香，味等品质也造成了一定的损害，从而暴露了传统杀菌技术的缺陷。为了杀灭食品中的芽孢杆菌，同时尽可能保留食品的色，香，味，一些新型的食品杀菌技术应运而生，目前针对芽孢的有效杀菌技术主要有：高温杀菌、欧姆加热杀菌、高压杀菌、间歇杀菌、电离辐射杀菌、磁波辐射杀菌、紫外线杀菌。与传统的高温杀菌相比，以上针对芽孢杆菌的杀菌技术均有区别于高温杀菌的优点。如：高压杀菌与传统的高温杀菌相比，高压杀菌可以实现对杀菌对象的快速加热和冷却，这是常规杀菌方法和杀菌设备无法达到的，且总的处理时间也较短 ，这使得高压杀菌对食品品质的影响不像传统热杀菌那么严重，在杀灭芽孢杆菌实现杀菌目的的同时，尽可能保留食品的色，香，味，满足人们对食品质量的要求[16-18]。
本文主要通过形态学、生理生化试验以及16S rRNA序列分析来鉴定菌种。
2 材料及方法
2.1 材料
2.1.1 样品
实验室从家庭自制香肠中分离筛选出一株耐热芽孢杆菌
2.1.2 试剂及仪器
试剂：可溶性淀粉，木糖，阿拉伯糖，乳糖，甘露醇，葡萄糖，半乳糖，蔗糖，壳聚糖，果糖，麦芽糖，甲基红，过氧化氢，肌酸，氢氧化钾，明胶，碘液，95%乙醇，吲哚试剂，番红染液，结晶紫，DNA酶，破菌缓冲液，乙酸铵，无水乙醇，TE缓冲液，琼脂糖凝胶等。
主要仪器：培养箱，超净工作台，灭菌锅，pH计，摇床，酸度计，离心机，电泳仪，恒温水浴锅，PCR扩增仪，振荡器，1.5ml离心管，0.2mlPCR管，冰箱等。
2.1.3 培养基
液体培养基 (g/L): 牛肉膏3、蛋白胨 10、氯化钠15、pH6.5-7.0 、121℃灭菌20mi
固体培养基 (g/L): 牛肉膏3、蛋白胨 10、氯化钠15、琼脂20、pH6.5-7.0、121℃灭菌20mi
甲基红与V-P培养基 (g/L)：蛋白胨 5、葡萄糖 5和氯化钠 5，pH6.5-7.0、115℃灭菌30 min
淀粉培养基[19] (g/L)：牛肉膏 3、蛋白胨 10、氯化钠 5、琼脂粉20和可溶性淀粉 2，pH6.5-7.0、121℃灭菌20 min
摘 要
芽孢杆菌对外界有害因子抵抗力
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关键字:芽孢杆菌香肠16SrDNA灭菌
目录
1. 引言1
1.1 芽孢杆菌的分类1
1.2 芽孢杆菌的应用1
1.2.1 芽孢杆菌在工业上的应用1
1.2.2 芽孢杆菌在农业业上的应1
1.2.3 芽孢杆菌在医学上的应用2
1.3 芽孢杆菌的危害2
2. 材料及方法3
2.1 材料3
2.1.1 样品3
2.1.2 试剂及仪器3
2.1.3 培养基3
2.2 实验方法3
2.2.1 菌种活化及分离 3
2.2.2 形态学鉴定3
2.2.3 生理生化试验4
2.2.4 16S rRNA序列分析5
2.2.5种子液制备6
2.2.6灭菌方法对芽孢杆菌的影响6
2.2.7菌落计数7
3. 结果及分析7
3.1 形态学鉴定结果7
3.2 生理生化试验结果8
3. 3 16S rRNA 序列鉴定9
3.3.1 PCR扩增结果.... 9
3.3.2 甲基营养型芽孢杆菌系统发育分析. 10
3. 4 灭菌方法对芽孢杆菌的影响 11
4. 小结 13
参考文献14
附录 .16
致谢17
1 前言
1.1 芽孢杆菌的分类
芽孢杆菌是在一定条件下可以形成芽孢的一类杆菌，包括多个菌属[1]，芽孢杆菌对外界有害因子抵抗力
二十世纪70年代和80年代，随着分子分类方法的的应用，越来越多的微生物被发现，被分离鉴定的芽孢杆菌菌种数量增加，分类地位确定的也越来越准确[5-7]。国外芽孢杆菌研究领域较为广泛，这一点我们可从《伯杰氏细菌鉴定手册》中看出。作为微生物分类领域比较著名的分类系统，《伯杰氏细菌鉴定手册》从1923年至今已出版9版，对芽孢杆菌的分类也逐步全面，芽孢杆菌属的物种数目归纳如下：第一版，发表于1923年，第二版，发表于1925年，这两版均把芽孢杆菌分为75种菌；第三版和第四版把芽孢杆菌分为93种菌，其中第三版发表于1930年，第四版发表于1934年；第五版发表于1939年，共记述146株芽孢杆菌； 第六版发表于1948年，共记述33株芽孢杆菌；第七版发表于1957年，共计25株芽孢杆菌；第八版发表于1974年，共计22株芽孢杆菌； 第九版，发表于1984年，根据《伯杰氏细菌鉴定手册》将芽孢杆菌分为4个大类 ，35个种群[8-11] 。
1.2 芽孢杆菌的应用[12]
1.2.1 芽孢杆菌在工业上的应用
芽孢杆菌具有很强的抑菌功能，可以通过占据有效空间位置，以此来抑制其他微生物的生长繁殖，可以作为一种有效地抑菌剂； 芽孢杆菌可以通过降解产生恶臭气味的有机物质除去臭味，很好的改善周围的环境；试验表明，芽孢杆菌能产生多种消化酶，在提高多种动物生产性能方面起着重要作用；芽孢杆菌具有丰富的酶活性，芽孢杆菌所含有的酶能够降解植物饲料细胞的细胞壁
1.2.2 芽孢杆菌在农业上的应用
芽孢杆菌在农业领域发挥着强大的功能，广泛应用于农作物肥料，农药的生产。从土壤中分离的芽孢杆菌具有很强的固氮能力，可以有效应用于氮肥的生产，由于芽孢具有很强的抗逆性，解决了氮肥容易污染变质或失水干燥的难题，从而既保证了氮肥的品质又延长了储存时间。另外芽孢杆菌的保湿能力很强，形成的天然材料聚麸胺酸具有良好的塑性和较高的强度 ，可以防止土壤中的水分和矿质元素的流失；芽孢杆菌是一种有机质分解能力很强的微生物，分解有机质的同时，释放出活性很高的酶，将一些难降解的大分子物质降解成可以利用的小分子物质；芽孢杆菌可以产生充足的的次级代谢物，合成多种生理活性物质。
1.2.3 芽孢杆菌在医学上的应用
芽孢杆菌在医学上主要是用于生产活菌制剂，目前芽孢杆菌生产的活菌制剂主要作为口服液用于治疗肠炎、支气管炎等多种疾病[13]。
1.3 芽孢杆菌的危害
芽孢的对人类的最大弊端是芽孢杆菌对外界有害因子抵抗力
本文主要通过形态学、生理生化试验以及16S rRNA序列分析来鉴定菌种。
2 材料及方法
2.1 材料
2.1.1 样品
实验室从家庭自制香肠中分离筛选出一株耐热芽孢杆菌
2.1.2 试剂及仪器
试剂：可溶性淀粉，木糖，阿拉伯糖，乳糖，甘露醇，葡萄糖，半乳糖，蔗糖，壳聚糖，果糖，麦芽糖，甲基红，过氧化氢，肌酸，氢氧化钾，明胶，碘液，95%乙醇，吲哚试剂，番红染液，结晶紫，DNA酶，破菌缓冲液，乙酸铵，无水乙醇，TE缓冲液，琼脂糖凝胶等。
主要仪器：培养箱，超净工作台，灭菌锅，pH计，摇床，酸度计，离心机，电泳仪，恒温水浴锅，PCR扩增仪，振荡器，1.5ml离心管，0.2mlPCR管，冰箱等。
2.1.3 培养基
液体培养基 (g/L): 牛肉膏3、蛋白胨 10、氯化钠15、pH6.5-7.0 、121℃灭菌20mi
固体培养基 (g/L): 牛肉膏3、蛋白胨 10、氯化钠15、琼脂20、pH6.5-7.0、121℃灭菌20mi
甲基红与V-P培养基 (g/L)：蛋白胨 5、葡萄糖 5和氯化钠 5，pH6.5-7.0、115℃灭菌30 min
淀粉培养基[19] (g/L)：牛肉膏 3、蛋白胨 10、氯化钠 5、琼脂粉20和可溶性淀粉 2，pH6.5-7.0、121℃灭菌20 min
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