乌饭树叶黄酮超声微波辅助醇提工艺及其抑菌活性1
乌饭树叶黄酮超声微波辅助醇提工艺及其抑菌活性1[20200408174606]
摘 要
以宜兴乌饭树叶（Vaccinium bmcteatum Thunb. Leaf, VBTL）为原料，以乙醇作为提取溶剂，利用超声-微波辅助技术对乌饭树叶黄酮进行提取，以乌饭树叶黄酮得率为指标，探讨乙醇体积分数、微波功率、时间和料液比对乌饭树叶黄酮得率的影响。在单因素实验的基础上，采用响应面分析法对超声-微波辅助醇提乌饭树叶黄酮最佳工艺条件进行优化。以抑菌圈直径和最小抑菌浓度为指标，采用管碟法、二倍稀释法探讨乌饭树叶黄酮对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、黑曲霉和酿酒酵母的体外抑菌作用。结果表明，超声-微波辅助醇提乌饭树叶黄酮的最佳提取工艺为：乙醇体积分数73%，时间40min，微波功率65W，料液比1:40（g/mL），在最佳工艺条件下，乌饭树叶黄酮得率为35.1195mg/g。乌饭树叶黄酮对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌具有明显的抑菌效果，对黑曲霉和酵母无抑菌效果。对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌的最小抑菌浓度分别为0.66mg/mL、0.33mg/mL、0.66mg/mL，乌饭树叶黄酮对金黄色葡萄球菌的抑菌效果最为显著。
*查看完整论文请 +Q: 3 5 1 9 1 6 0 7 2
关键字:乌饭树叶黄酮超声-微波辅助提取技术响应面法抑菌
目 录
1. 引言 1
1.1 乌饭树的生物学概况 1
1.1.1 特征 1
1.1.2 乌饭树叶价值 1
1.2 乌饭树叶黄酮的研究现状 1
1.3 本论文研究的意义 2
2. 实验材料与方法 3
2.1 实验材料和试剂 3
2.2 实验设备 3
2.3 实验方法 3
2.3.1 乌饭树叶预处理 3
2.3.2 标准曲线的绘制 AlCl3法 3
2.3.3 乌饭树叶黄酮的提取 3
2.3.4 乌饭树叶黄酮的测定 4
2.3.5 乌饭树叶黄酮体外抑菌试验 4
3. 结果与分析 6
3.1 标准曲线的绘制 6
3.2 热水浴醇提法 6
3.2.1 乙醇体积分数对乌饭树叶黄酮得率的影响 6
3.2.2 时间对乌饭树叶黄酮得率的影响 6
3.2.3 温度对乌饭树叶黄酮得率的影响 7
3.2.4 料液比对乌饭树叶黄酮得率的影响 7
3.2.5 正交设计实验 8
3.3 超声-微波辅助醇提乌饭树叶黄酮 9
3.3.1 乙醇体积分数对乌饭树叶黄酮得率的影响 9
3.3.2 时间对乌饭树叶黄酮得率的影响 9
3.3.3 微波功率对乌饭树叶黄酮得率的影响 10
3.3.4 料液比对乌饭树叶黄酮得率的影响 10
3.3.5 响应面法优化实验 11
3.3.6 热水浴醇提和超声-微波醇提的对比 15
3.4 乌饭树叶黄酮的抑菌活性研究 16
3.4.1 抑菌圈直径的测定 16
3.4.2 最小抑菌浓度（MIC）的测定 16
4. 结论 17
参考文献 18
致谢 19
1. 引言
1.1 乌饭树的生物学概况
1.1.1 特征
乌饭树，亦称南烛，属杜鹃花科常绿灌木。广泛生长在长江以南地区，通常分布在丘陵地带或者400-1400m海拔的山坡林中，是酸性土壤的指示性植物[1]。当代的研究证实乌饭树叶中内含成分包括无羁萜（酮）、槲皮素、异荭草素、对羟基桂皮酸[2]。鲁植雄等[3]人用超临界CO2法萃取乌饭树叶，得出如下结论萃取物中槲皮素占到3.52%，总黄酮占有11.64%。
1.1.2 乌饭树叶价值
乌饭树的根、叶、果实皆可入药。叶的药用效果显著。在清代，名医沈金鳌在《要药分剂》也写到：“枝叶载有止泄、除睡、变白三条”[1]。
现代医学研究发现，乌饭树叶具有良好的药理学作用。乌饭树叶的乙醇提取物有着抗炎和抗氧化活性；乌饭树叶黄酮对细菌具有一定的抑菌作用；乌饭树叶提取物能够抑制小鼠宫颈癌细胞株的生长；乌饭树叶水提物能够有效降低血糖和血脂水平，故而具有降血糖降血脂作用；乌饭树叶提取物能够改善视网膜功能，从而保护视网膜，避免损伤[4]。
除了药用价值，乌饭树叶亦开发成保健食品、营养饮料等商用价值，目前市面上已经存在了部分和乌饭树叶有关的产品。例如浓缩越桔果、多维果酱等系列产品[2]。我国江苏、浙江、安徽、江西等多地都有吃乌米饭的习俗，乌饭树叶洗净与米饭共同蒸煮，蒸煮出来的米饭呈乌黑色即为乌米饭。由此看来，乌饭树叶开发成商品，不仅是对乌饭树叶用途的丰富，而且可以产生极大的社会效应，对于保健品业、饮料业、农业都有着极大的价值。
1.2 乌饭树叶黄酮的研究现状
目前我国学者对于乌饭树树叶黄酮的提取方式大多较为传统。多为蒸馏水提取或乙醇提取。刘建平等[5]人利用蒸馏水提取法得到乌饭树叶黄酮的提取参数：提取时间150 min，浸提温度65 ℃，料液比1:50（g/mL）。在一些辅助性提取方法上，也有超声波辅助，微波辅助提取等技术，魏国华[6]采用59KHz的超声频率提取乌饭树叶黄酮，通过正交实验确定了乌饭树叶黄酮提取参数：提取次数2次，时间20min，乙醇体积分数60％，料液比1:10(g/mL)；胡志杰等[7]人以提取液的吸光度为指标进行试验，利用正交设计实验得到最佳工艺参数：料液比1:15(g/mL)，提取液浓度40％，微波功率300W和辐照时间60s。
关于乌饭树叶黄酮抑菌作用的研究，目前国内已发表的文献中较少，以乌饭树叶水溶性提取物、醇溶性提取物的抑菌作用研究为主。章海燕等[8-9]人水提和醇提乌饭树叶黄酮进行抑菌实验，发现对细菌的抑制成效显著，但对霉菌和酵母的抑菌成效不显著。
1.3 本论文研究的意义
综合大量文献来看，目前乌饭树叶黄酮的提取工艺以蒸馏水提取、乙醇提取为主，超声波辅助与微波辅助提取方式虽有应用，但是均采用单一技术，两者相结合的超声-微波辅助醇提乌饭树叶黄酮的报道还未见到。国内外对于乌饭树叶黄酮抑菌性研究较为罕见，超声-微波辅助醇提法得到乌饭树叶黄酮的抑菌性研究尚未见报道。
超声波是一种需要传播介质的机械波。在一般情况下，超声波致使介质产生交替压缩和解压缩[10]。利用超声的能量，可以改变物质组织结构和状态，当其应用于固液系统的萃取中时，可以强化萃取过程，加速可逆过程宏观上单方面进行，有利于有效成分快速浸出。
微波是一种电磁波，微波萃取是利用微波作用使细胞壁破碎，从而提高有效成分的提取率。该技术具有反应灵敏、受热均匀等特点[11]。超声-微波辅助提取技术是结合超声波提取技术和微波提取技术优点于一身的新型提取技术。该技术具有高效、环保、安全的优点[12]。
无论在世界各国，在食品生产过程中，为了保障食品的高品质，延长食品储存的保藏期。时常采用高温灭菌的方式，然而很多食品一旦经过高温处理，便会破坏食品结构，影响食品的品质或者口感。因此，化学防腐剂应运而生。随着化学防腐剂应用的普及，诞生了很多安全性问题，人们渴望一种新型天然可食用的防腐剂来替代化学防腐剂[9]。
本论文拟采用超声-微波辅助提取关键技术，优化乌饭树叶黄酮超声-微波辅助提取工艺，并探讨醇溶性乌饭树叶黄酮的抑菌活性，解决乌饭树叶黄酮提取率低等缺点，旨在为开发一种乌饭树叶黄酮天然植物防腐剂奠定基础，提高乌饭树的附加值。
2. 实验材料与方法
2.1 实验材料和试剂
乌饭树叶（宜兴）、芦丁标准品、无水乙醇（分析纯）、三氯化铝等。
牛肉膏蛋白胨固体培养基、牛肉膏蛋白胨液体培养基、霉菌马铃薯培养基（PDA）、酵母培养基（YPD）。
大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、黑曲霉、酿酒酵母(微生物实验室)。
2.2 实验设备
超声-微波协同萃取仪（CW-2000 中国·上海新拓分析仪器科技有限公司）
精密天平（PGC-753e 艾德姆衡器）
数显恒温水浴锅（HH-2 金坛市杰瑞尔电器有限公司）
1000克摇摆式高速中药粉碎机（HK-20B 广州市旭朗机械设备有限公司）
摘 要
以宜兴乌饭树叶（Vaccinium bmcteatum Thunb. Leaf, VBTL）为原料，以乙醇作为提取溶剂，利用超声-微波辅助技术对乌饭树叶黄酮进行提取，以乌饭树叶黄酮得率为指标，探讨乙醇体积分数、微波功率、时间和料液比对乌饭树叶黄酮得率的影响。在单因素实验的基础上，采用响应面分析法对超声-微波辅助醇提乌饭树叶黄酮最佳工艺条件进行优化。以抑菌圈直径和最小抑菌浓度为指标，采用管碟法、二倍稀释法探讨乌饭树叶黄酮对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、黑曲霉和酿酒酵母的体外抑菌作用。结果表明，超声-微波辅助醇提乌饭树叶黄酮的最佳提取工艺为：乙醇体积分数73%，时间40min，微波功率65W，料液比1:40（g/mL），在最佳工艺条件下，乌饭树叶黄酮得率为35.1195mg/g。乌饭树叶黄酮对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌具有明显的抑菌效果，对黑曲霉和酵母无抑菌效果。对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌的最小抑菌浓度分别为0.66mg/mL、0.33mg/mL、0.66mg/mL，乌饭树叶黄酮对金黄色葡萄球菌的抑菌效果最为显著。
*查看完整论文请 +Q: 3 5 1 9 1 6 0 7 2
关键字:乌饭树叶黄酮超声-微波辅助提取技术响应面法抑菌
目 录
1. 引言 1
1.1 乌饭树的生物学概况 1
1.1.1 特征 1
1.1.2 乌饭树叶价值 1
1.2 乌饭树叶黄酮的研究现状 1
1.3 本论文研究的意义 2
2. 实验材料与方法 3
2.1 实验材料和试剂 3
2.2 实验设备 3
2.3 实验方法 3
2.3.1 乌饭树叶预处理 3
2.3.2 标准曲线的绘制 AlCl3法 3
2.3.3 乌饭树叶黄酮的提取 3
2.3.4 乌饭树叶黄酮的测定 4
2.3.5 乌饭树叶黄酮体外抑菌试验 4
3. 结果与分析 6
3.1 标准曲线的绘制 6
3.2 热水浴醇提法 6
3.2.1 乙醇体积分数对乌饭树叶黄酮得率的影响 6
3.2.2 时间对乌饭树叶黄酮得率的影响 6
3.2.3 温度对乌饭树叶黄酮得率的影响 7
3.2.4 料液比对乌饭树叶黄酮得率的影响 7
3.2.5 正交设计实验 8
3.3 超声-微波辅助醇提乌饭树叶黄酮 9
3.3.1 乙醇体积分数对乌饭树叶黄酮得率的影响 9
3.3.2 时间对乌饭树叶黄酮得率的影响 9
3.3.3 微波功率对乌饭树叶黄酮得率的影响 10
3.3.4 料液比对乌饭树叶黄酮得率的影响 10
3.3.5 响应面法优化实验 11
3.3.6 热水浴醇提和超声-微波醇提的对比 15
3.4 乌饭树叶黄酮的抑菌活性研究 16
3.4.1 抑菌圈直径的测定 16
3.4.2 最小抑菌浓度（MIC）的测定 16
4. 结论 17
参考文献 18
致谢 19
1. 引言
1.1 乌饭树的生物学概况
1.1.1 特征
乌饭树，亦称南烛，属杜鹃花科常绿灌木。广泛生长在长江以南地区，通常分布在丘陵地带或者400-1400m海拔的山坡林中，是酸性土壤的指示性植物[1]。当代的研究证实乌饭树叶中内含成分包括无羁萜（酮）、槲皮素、异荭草素、对羟基桂皮酸[2]。鲁植雄等[3]人用超临界CO2法萃取乌饭树叶，得出如下结论萃取物中槲皮素占到3.52%，总黄酮占有11.64%。
1.1.2 乌饭树叶价值
乌饭树的根、叶、果实皆可入药。叶的药用效果显著。在清代，名医沈金鳌在《要药分剂》也写到：“枝叶载有止泄、除睡、变白三条”[1]。
现代医学研究发现，乌饭树叶具有良好的药理学作用。乌饭树叶的乙醇提取物有着抗炎和抗氧化活性；乌饭树叶黄酮对细菌具有一定的抑菌作用；乌饭树叶提取物能够抑制小鼠宫颈癌细胞株的生长；乌饭树叶水提物能够有效降低血糖和血脂水平，故而具有降血糖降血脂作用；乌饭树叶提取物能够改善视网膜功能，从而保护视网膜，避免损伤[4]。
除了药用价值，乌饭树叶亦开发成保健食品、营养饮料等商用价值，目前市面上已经存在了部分和乌饭树叶有关的产品。例如浓缩越桔果、多维果酱等系列产品[2]。我国江苏、浙江、安徽、江西等多地都有吃乌米饭的习俗，乌饭树叶洗净与米饭共同蒸煮，蒸煮出来的米饭呈乌黑色即为乌米饭。由此看来，乌饭树叶开发成商品，不仅是对乌饭树叶用途的丰富，而且可以产生极大的社会效应，对于保健品业、饮料业、农业都有着极大的价值。
1.2 乌饭树叶黄酮的研究现状
目前我国学者对于乌饭树树叶黄酮的提取方式大多较为传统。多为蒸馏水提取或乙醇提取。刘建平等[5]人利用蒸馏水提取法得到乌饭树叶黄酮的提取参数：提取时间150 min，浸提温度65 ℃，料液比1:50（g/mL）。在一些辅助性提取方法上，也有超声波辅助，微波辅助提取等技术，魏国华[6]采用59KHz的超声频率提取乌饭树叶黄酮，通过正交实验确定了乌饭树叶黄酮提取参数：提取次数2次，时间20min，乙醇体积分数60％，料液比1:10(g/mL)；胡志杰等[7]人以提取液的吸光度为指标进行试验，利用正交设计实验得到最佳工艺参数：料液比1:15(g/mL)，提取液浓度40％，微波功率300W和辐照时间60s。
关于乌饭树叶黄酮抑菌作用的研究，目前国内已发表的文献中较少，以乌饭树叶水溶性提取物、醇溶性提取物的抑菌作用研究为主。章海燕等[8-9]人水提和醇提乌饭树叶黄酮进行抑菌实验，发现对细菌的抑制成效显著，但对霉菌和酵母的抑菌成效不显著。
1.3 本论文研究的意义
综合大量文献来看，目前乌饭树叶黄酮的提取工艺以蒸馏水提取、乙醇提取为主，超声波辅助与微波辅助提取方式虽有应用，但是均采用单一技术，两者相结合的超声-微波辅助醇提乌饭树叶黄酮的报道还未见到。国内外对于乌饭树叶黄酮抑菌性研究较为罕见，超声-微波辅助醇提法得到乌饭树叶黄酮的抑菌性研究尚未见报道。
超声波是一种需要传播介质的机械波。在一般情况下，超声波致使介质产生交替压缩和解压缩[10]。利用超声的能量，可以改变物质组织结构和状态，当其应用于固液系统的萃取中时，可以强化萃取过程，加速可逆过程宏观上单方面进行，有利于有效成分快速浸出。
微波是一种电磁波，微波萃取是利用微波作用使细胞壁破碎，从而提高有效成分的提取率。该技术具有反应灵敏、受热均匀等特点[11]。超声-微波辅助提取技术是结合超声波提取技术和微波提取技术优点于一身的新型提取技术。该技术具有高效、环保、安全的优点[12]。
无论在世界各国，在食品生产过程中，为了保障食品的高品质，延长食品储存的保藏期。时常采用高温灭菌的方式，然而很多食品一旦经过高温处理，便会破坏食品结构，影响食品的品质或者口感。因此，化学防腐剂应运而生。随着化学防腐剂应用的普及，诞生了很多安全性问题，人们渴望一种新型天然可食用的防腐剂来替代化学防腐剂[9]。
本论文拟采用超声-微波辅助提取关键技术，优化乌饭树叶黄酮超声-微波辅助提取工艺，并探讨醇溶性乌饭树叶黄酮的抑菌活性，解决乌饭树叶黄酮提取率低等缺点，旨在为开发一种乌饭树叶黄酮天然植物防腐剂奠定基础，提高乌饭树的附加值。
2. 实验材料与方法
2.1 实验材料和试剂
乌饭树叶（宜兴）、芦丁标准品、无水乙醇（分析纯）、三氯化铝等。
牛肉膏蛋白胨固体培养基、牛肉膏蛋白胨液体培养基、霉菌马铃薯培养基（PDA）、酵母培养基（YPD）。
大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、黑曲霉、酿酒酵母(微生物实验室)。
2.2 实验设备
超声-微波协同萃取仪（CW-2000 中国·上海新拓分析仪器科技有限公司）
精密天平（PGC-753e 艾德姆衡器）
数显恒温水浴锅（HH-2 金坛市杰瑞尔电器有限公司）
1000克摇摆式高速中药粉碎机（HK-20B 广州市旭朗机械设备有限公司）
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