瑞士乳杆菌mb21对不同种类蛋白水解能力及其产物抗氧化活性分析
摘要： 本文以牛奶蛋白、酪蛋白和乳清蛋白为原料，以瑞士乳杆菌MB2-1（Lactobacillus helveticus MB2-1）为发酵菌株。通过蛋白电泳和高效液相色谱，分析不同蛋白随时间推移的降解情况，并得到最终降解产物。通过测定DPPH·自由基活性和金属离子螯合能力来测定蛋白水解产物抗氧化活性。结果表明，随着水解时间的推移，瑞士乳杆菌MB2-1对三种蛋白的水解作用都不断递增。随着蛋白水解产物质量浓度的提高，蛋白水解产物的抗氧化活性有明显增强。当牛奶蛋白水解时间为36 h，浓度为4 mg/mL时，测得其DPPH·自由基清除率为70.9%，金属离子螯合力为68.9%。分别与阳性对照相比较，可见其具有较强的清除DPPH·自由基的活性和中等的金属离子螯合能力。在相同的水解产物质量浓度时，水解时间越长，蛋白水解产物抗氧化活性越强。说明随着时间的推移，产生了更多具有抗氧化活性的小肽。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1 材料与方法2
1.1 材料 2
1.1.1 菌种2
1.1.2 培养基2
1.1.3 主要试剂3
1.1.4 主要仪器3
1.2 方法 3
1.2.1发酵乳培养3
1.2.2 SDSPAGE法测定蛋白质含量及变化3
1.2.2.1 浓缩胶和分离胶的选择及配方3
1.2.2.2 样品制备4
1.2.3 高效液相色谱(HPLC)法测定小肽含量及变化 4
1.2.3.2 样品处理 4
1.2.3.2 色谱条件 4
1.2.4 蛋白水解产物抗氧化活性研究4
1.2.4.1 样品处理4
1.2.4.2 清除DPPH自由基活性的测定4
1.2.4.3 螯合金属能力的测定5
2 结果与分析5
2.1 瑞士乳杆菌MB21对不同蛋白的水解能力5
2.1.1 瑞士乳杆菌MB21对牛奶蛋白的水解能力5
2.1.2 瑞士乳杆菌MB21对酪蛋白的水解能力6<
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^3^5`1^9`1^6^0`7^2#
br /> 2.1.3 瑞士乳杆菌MB21对乳清蛋白的水解能力7
2.2 牛奶蛋白水解产物抗氧化活性研究8
2.2.1 牛奶蛋白水解产物对DPPH自由基的清除活性8
2.2.2 牛奶蛋白水解产物对金属离子的螯合能力9
3 讨论10
致谢10
参考文献10
瑞士乳杆菌MB21对不同种类蛋白水解能力
及其产物抗氧化活性分析
引言
引言 自由基研究理论表明，富含活性氧或氧来源的自由基能够引发病理学效应，甚至能够诱导诸多疾病[1]。为了解决或减轻含氧自由基的危害，食品工业中广泛使用抗氧化剂来达到这一目的。然而，一些人工合成的抗氧化剂具有一定的致癌性，容易造成人体内部器官的损坏。因此，一些来源于动物和微生物的天然抗氧化剂受到了人们的青睐[2]。
乳蛋白是一种营养全价的蛋白质，除了作为人类主要的膳食蛋白外，还是多种生物活性物质的主要来源。至今，人们已从乳蛋白中获得了多种生物活性肽。乳源生物活性肽的优势己得到国际公认，特别是短肽的发现已经成为多肽类药物和功能性食品添加剂的开发热点[3]。乳酸菌（Lactic acid bacterium, LAB）是一群能从可发酵性碳水化合物中产生大量乳酸的革兰氏阳性细菌的通称。乳酸杆菌有44个种，连同亚种共51个种，是革兰氏阳性、无芽抱、细长和有弯曲的杆菌[4]。大量研究资料表明，乳酸菌能调节胃肠道正常菌群和维持微生态平衡，从而改善胃肠道功能;提高食物消化率和生物效价;降低血清胆固醇，控制内毒素；抑制肠道内腐败菌生长和提高机体免疫力等。总之，乳酸菌的生理功能与机体的生命活动息息相关[3]。瑞士乳杆菌是一种具有保健功效的新型酸奶生产菌种，在众多乳酸菌中，瑞士乳杆菌具有较强的蛋白水解活性，可缩短制造时间，被广泛用于发酵乳制品的发酵剂中，它所发酵的乳制品所含肽的浓度较高。瑞士乳杆菌不仅是人体肠道的益生菌，而且能水解乳蛋白产生乳蛋白源生物活性肽。其水解产生的抗氧化肽能有效地清除体内过剩的活性氧自由基，保护细胞和线粒体的正常结构和功能，防止脂质过氧化的发生。国内外的研究表明，乳源性抗氧化抑制肽具有安全性高、无副作用等优点。在以天然、健康为主题的今天，人们越来越倾向预防保健和食疗，因此来源于食品的抗氧化肽，尤其是乳源抗氧化肽在国内外具有巨大的潜在市场。利用瑞士乳杆菌生产出高抗氧化活性的产品，显现出一定的开发推广前景[6]。
本实验主要致力于分析瑞士乳杆菌分解牛奶蛋白、酪蛋白和乳清蛋白的产物并对产物的抗氧化活性进行研究。对于抗氧化产品的开发只是作了初步的探讨，旨在促进益生菌的开发利用和功能性食品的发展。
1 材料与方法
1. 1 材料
1. 1. 1 菌种
瑞士乳杆菌MB21 瑞士乳杆菌MB21（Lactobacillus helveticus MB21）（图1）由大学食品科技学院微生物实验室分离自新疆非物质文化遗产——拜城酸奶中。
图1 瑞士乳杆菌MB21油镜下形态（10× 100）
Fig 1. Oil microscopic morphology of L. helveticus MB21(10× 100)
1. 1. 2 培养基
10%脱脂乳粉培养基、12%脱脂乳粉培养基、以酪蛋白取代氮源的改良MRS培养基和以乳清蛋白取代氮源的改良MRS培养基
1. 1. 3 主要试剂
葡萄糖、无水乙酸钠、三水合磷酸氢二钾、柠檬酸三铵、七水合硫酸镁、一水合硫酸锰、吐温80、氯化钙、氯化钠、抗坏血酸钠、氢氧化钠、浓硫酸、乙二胺四乙酸、三羟甲基氨基甲烷、乳酸、甘油、甲醇、磷酸氢二钠、二水合磷酸二氢钠、1,10菲咯啉、过氧化氢、氯化亚铁、硫酸亚铁、乙二胺乙酸二钠盐、铁氰化钾、三氯化铁、冰醋酸、盐酸等均为常规分析纯试剂。
D半乳糖、菲啰嗪、2,3,5三苯基氯化四氮唑、氯化硝基四氮唑蓝、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸等均购自美国Sigma公司。
1. 1. 4 主要仪器
MP2002电子天平（上海舜宇恒平科学仪器有限公司）、XP105DR分析天平（瑞士METTLER TOLEDO公司）、LRH系列生化培养箱（上海一恒科学仪器有限公司）、IS128实验室PH计（上海仪迈仪器科技有限公司）、SWCJIFD洁净工作台（江苏苏净集团苏州安泰空气技术有限公司）、HH4数显恒温水浴锅（江苏常州国华电器有限公司）、GZX9140MBE数显鼓风干燥箱（上海博讯实业有限公司医疗设备厂）、CT15RT台式高速冷冻离心机（中国香港TECHCOMP科学仪器有限公司）、115PK离心机（德国SIGMA公司）、LDZX50KBS立式压力蒸汽灭菌锅（上海申安医疗器械厂）、722型可见分光光度计(上海菁华科技仪器有限公司)、FreeZone?冷冻干燥机（美国LABCONCO）、XW80A漩涡混合器（上海青浦沪西仪器厂）、THZC恒温震荡器（江苏苏州培英实验设备有限公司）、MP8003Mini P4小型垂直电泳两块胶系统（美国BioRad公司）、DYY2C型电泳仪（北京六一仪器厂）、TY80R脱色摇床（江苏省金坛市医疗仪器厂）、GenoSens1810凝胶成像系统（上海勤翔科学仪器有限公司）、Agilent1200系列高效液相色谱仪（上海安捷伦科技有限公司）、UP250HE数控超声波清洗器（南京垒君达超声电子设备有限公司）
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1 材料与方法2
1.1 材料 2
1.1.1 菌种2
1.1.2 培养基2
1.1.3 主要试剂3
1.1.4 主要仪器3
1.2 方法 3
1.2.1发酵乳培养3
1.2.2 SDSPAGE法测定蛋白质含量及变化3
1.2.2.1 浓缩胶和分离胶的选择及配方3
1.2.2.2 样品制备4
1.2.3 高效液相色谱(HPLC)法测定小肽含量及变化 4
1.2.3.2 样品处理 4
1.2.3.2 色谱条件 4
1.2.4 蛋白水解产物抗氧化活性研究4
1.2.4.1 样品处理4
1.2.4.2 清除DPPH自由基活性的测定4
1.2.4.3 螯合金属能力的测定5
2 结果与分析5
2.1 瑞士乳杆菌MB21对不同蛋白的水解能力5
2.1.1 瑞士乳杆菌MB21对牛奶蛋白的水解能力5
2.1.2 瑞士乳杆菌MB21对酪蛋白的水解能力6<
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^3^5`1^9`1^6^0`7^2#
br /> 2.1.3 瑞士乳杆菌MB21对乳清蛋白的水解能力7
2.2 牛奶蛋白水解产物抗氧化活性研究8
2.2.1 牛奶蛋白水解产物对DPPH自由基的清除活性8
2.2.2 牛奶蛋白水解产物对金属离子的螯合能力9
3 讨论10
致谢10
参考文献10
瑞士乳杆菌MB21对不同种类蛋白水解能力
及其产物抗氧化活性分析
引言
引言 自由基研究理论表明，富含活性氧或氧来源的自由基能够引发病理学效应，甚至能够诱导诸多疾病[1]。为了解决或减轻含氧自由基的危害，食品工业中广泛使用抗氧化剂来达到这一目的。然而，一些人工合成的抗氧化剂具有一定的致癌性，容易造成人体内部器官的损坏。因此，一些来源于动物和微生物的天然抗氧化剂受到了人们的青睐[2]。
乳蛋白是一种营养全价的蛋白质，除了作为人类主要的膳食蛋白外，还是多种生物活性物质的主要来源。至今，人们已从乳蛋白中获得了多种生物活性肽。乳源生物活性肽的优势己得到国际公认，特别是短肽的发现已经成为多肽类药物和功能性食品添加剂的开发热点[3]。乳酸菌（Lactic acid bacterium, LAB）是一群能从可发酵性碳水化合物中产生大量乳酸的革兰氏阳性细菌的通称。乳酸杆菌有44个种，连同亚种共51个种，是革兰氏阳性、无芽抱、细长和有弯曲的杆菌[4]。大量研究资料表明，乳酸菌能调节胃肠道正常菌群和维持微生态平衡，从而改善胃肠道功能;提高食物消化率和生物效价;降低血清胆固醇，控制内毒素；抑制肠道内腐败菌生长和提高机体免疫力等。总之，乳酸菌的生理功能与机体的生命活动息息相关[3]。瑞士乳杆菌是一种具有保健功效的新型酸奶生产菌种，在众多乳酸菌中，瑞士乳杆菌具有较强的蛋白水解活性，可缩短制造时间，被广泛用于发酵乳制品的发酵剂中，它所发酵的乳制品所含肽的浓度较高。瑞士乳杆菌不仅是人体肠道的益生菌，而且能水解乳蛋白产生乳蛋白源生物活性肽。其水解产生的抗氧化肽能有效地清除体内过剩的活性氧自由基，保护细胞和线粒体的正常结构和功能，防止脂质过氧化的发生。国内外的研究表明，乳源性抗氧化抑制肽具有安全性高、无副作用等优点。在以天然、健康为主题的今天，人们越来越倾向预防保健和食疗，因此来源于食品的抗氧化肽，尤其是乳源抗氧化肽在国内外具有巨大的潜在市场。利用瑞士乳杆菌生产出高抗氧化活性的产品，显现出一定的开发推广前景[6]。
本实验主要致力于分析瑞士乳杆菌分解牛奶蛋白、酪蛋白和乳清蛋白的产物并对产物的抗氧化活性进行研究。对于抗氧化产品的开发只是作了初步的探讨，旨在促进益生菌的开发利用和功能性食品的发展。
1 材料与方法
1. 1 材料
1. 1. 1 菌种
瑞士乳杆菌MB21 瑞士乳杆菌MB21（Lactobacillus helveticus MB21）（图1）由大学食品科技学院微生物实验室分离自新疆非物质文化遗产——拜城酸奶中。
图1 瑞士乳杆菌MB21油镜下形态（10× 100）
Fig 1. Oil microscopic morphology of L. helveticus MB21(10× 100)
1. 1. 2 培养基
10%脱脂乳粉培养基、12%脱脂乳粉培养基、以酪蛋白取代氮源的改良MRS培养基和以乳清蛋白取代氮源的改良MRS培养基
1. 1. 3 主要试剂
葡萄糖、无水乙酸钠、三水合磷酸氢二钾、柠檬酸三铵、七水合硫酸镁、一水合硫酸锰、吐温80、氯化钙、氯化钠、抗坏血酸钠、氢氧化钠、浓硫酸、乙二胺四乙酸、三羟甲基氨基甲烷、乳酸、甘油、甲醇、磷酸氢二钠、二水合磷酸二氢钠、1,10菲咯啉、过氧化氢、氯化亚铁、硫酸亚铁、乙二胺乙酸二钠盐、铁氰化钾、三氯化铁、冰醋酸、盐酸等均为常规分析纯试剂。
D半乳糖、菲啰嗪、2,3,5三苯基氯化四氮唑、氯化硝基四氮唑蓝、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸等均购自美国Sigma公司。
1. 1. 4 主要仪器
MP2002电子天平（上海舜宇恒平科学仪器有限公司）、XP105DR分析天平（瑞士METTLER TOLEDO公司）、LRH系列生化培养箱（上海一恒科学仪器有限公司）、IS128实验室PH计（上海仪迈仪器科技有限公司）、SWCJIFD洁净工作台（江苏苏净集团苏州安泰空气技术有限公司）、HH4数显恒温水浴锅（江苏常州国华电器有限公司）、GZX9140MBE数显鼓风干燥箱（上海博讯实业有限公司医疗设备厂）、CT15RT台式高速冷冻离心机（中国香港TECHCOMP科学仪器有限公司）、115PK离心机（德国SIGMA公司）、LDZX50KBS立式压力蒸汽灭菌锅（上海申安医疗器械厂）、722型可见分光光度计(上海菁华科技仪器有限公司)、FreeZone?冷冻干燥机（美国LABCONCO）、XW80A漩涡混合器（上海青浦沪西仪器厂）、THZC恒温震荡器（江苏苏州培英实验设备有限公司）、MP8003Mini P4小型垂直电泳两块胶系统（美国BioRad公司）、DYY2C型电泳仪（北京六一仪器厂）、TY80R脱色摇床（江苏省金坛市医疗仪器厂）、GenoSens1810凝胶成像系统（上海勤翔科学仪器有限公司）、Agilent1200系列高效液相色谱仪（上海安捷伦科技有限公司）、UP250HE数控超声波清洗器（南京垒君达超声电子设备有限公司）
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