葡萄酵母菌的分离与分子生物学鉴定
摘要：本实验主要以夏黑无籽葡萄为实验材料，采用梯度稀释法和划线纯化法，对葡萄表面微生物进行分离与纯化，最终得到两株菌株S-2和S-5。提取酵母菌株DNA，并以分离得到的葡萄酵母菌26S rDNA基因D1/D2区的DNA序列为模板，NL1/NL4为引物，进行PCR扩增，再将PCR产物进行回收与克隆，测序后进行blast对比鉴定，根据26S rDNA序列使用邻接法构建系统发育树。同时，结合形态学方法对酵母菌进行鉴定。分离纯化得到的酵母菌S-2、S-5经鉴定分别为，陆生伊萨酵母（Issatchenkiaterricola）和毕赤酵母（Pichia eremophila）。
目录
摘要 1
关键词 1
Abstract 1
Key words 1
1 材料与方法 2
1．1 材料 2
1．1．1 实验材料 2
1．1．2 培养基 2
1. 1. 3 主要试剂 2
1. 1. 4 主要仪器 3
1．2 葡萄酵母菌株的分离与保藏 3
1. 2. 1 葡萄酵母菌株的分离 3
1. 2. 2 葡萄酵母菌株的保藏 3
1. 2. 3 葡萄酵母的形态学鉴定 3
1. 3 葡萄酵母菌的分子生物学鉴定 3
1. 3. 1 DNA的提取 3
1. 3. 2 目的基因的PCR扩增 3
1. 3. 3 PCR产物的回收与克隆 3
1. 3. 4 测序及构建系统发育树 4
2 结果与分析 4
2. 1 葡萄酵母菌的分离和筛选 4
2. 2 葡萄酵母菌形态特征 4
2．3 葡萄酵母菌的分子生物学鉴定 5
2. 3. 1 葡萄酵母菌目的基因片段扩增 5
2. 3. 2 测序结果与同源性对比 6
3 讨论 7
致谢 8
参考文献 8
葡萄酵母菌的分离与分子生物学鉴定
引言
葡萄在我国各地均有种植，葡萄果实中含有的各种营养元
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: ￥3^5`1^9`1^6^0`7^2$
素，如维生素，矿物质，碳水化合物，膳食纤维和植物化学成分，可起到抗衰老、抗肿瘤、美容养颜等多种功效。葡萄酒因美味可口、营养丰富、有益于人体健康而越来越受到人们的喜爱和追捧[1]。葡萄酒的酿造过程中，最重要的微生物就是酵母菌，它起着提高产品产量，改善产品质量已经增加风味物质的作用[2]。
在多年栽种葡萄的园区中,有很多种天然酵母菌与其寄主相伴而生,经过长时间的自然选择和演变进化，逐渐孕育了一些适于当地环境条件和葡萄品种的优势天然酵母菌,常在葡萄酒生产过程中中,随同原料参与葡萄酒的酿造过程,对具有不同地域特色的葡萄酒的品质和风格形成发挥了十分重要的作用[3]。
到目前为止，葡萄酒行业已经发展了许多年，但葡萄酒在全球范围内已经出现了“同质化”现象，生产者们正在面临着重大的风险与考验。因此，如何酿造出具有独特风格和特色的葡萄酒已成为一个全球性的课题。从葡萄品种原产地筛选出具有具有当地品种特色的酵母菌已成为科学家们近期研究的一个重要途径和方向，对酿出具有当地特色、又有品种典型性的葡萄酒有很大的帮助[4]。
常规的鉴定酵母菌是通过形态学特征进行鉴定的，通常大家也会使用酵母菌的生理特征进行辅助鉴定。一般情况下，要使用该方法对一株菌株进行鉴定，工作量十分大，消耗时间，并且结果还具有不确定性，其特征容易受到培养环境的影响出现误差[5]。伴随着生物技术的日益发展，使用分子生物学技术对酵母菌进行鉴定的方式已渐渐成为最重要和最常用的方法，主要包括DNA限制性片段多态性分析(PCRRFLP)，核糖体DNA序列分析，脉冲电泳核型分析(PFGE)，随机扩增多态性DNA（RAPD），以及TRFLP、实时PCR技术(RealtimePCR)、DNA重组探针的指纹图谱技术和微卫星分子标记技术等。
Kuttzman&Robnett(1998)测定了大约500种酵母菌的大亚基26S rDNA的D1/D2可变区的序列，发现使用这段序列(500bp600bp)能够将酵母菌属绝大部分的种进行区分，核苷酸序列相差小于1％的一般为同一个种[6]。GUTELL等[7]研究表明，D1/D2这段区域的序列具有较高的差异，可以用于亲缘关系较近的菌株，即种与种相互之间的分类研究。这些序列在像NCBI（National Center for Biotechnoligy Information）等国际核酸序列数据库中均已公布，使得序列的比对更加简便，也更具可行性[8]。
26S rDNA基因D1/D2区序列分析的方法，主要是通过对比26S rDNA的D1/D2区域的序列进行鉴定的。序列分析的主要流程是：提取菌株的基因组DNA，以该DNA为模板使用NL1/NL4为引物PCR扩增相应的区域，使用琼脂糖凝胶检测目的DNA片段，纯化后测序，将得到的序列在数据库中进行比对。碱基之间区别越小的序列相似度就越高，成为该序列所对应菌种的可能性就越大。同时，可以从一些国际数据库中下载一些同源性高的序列，使用软件构建发育树，并进行种属分析。
本实验主要以夏黑无籽葡萄为实验材料，采用梯度稀释法和划线纯化法，对葡萄表面微生物进行分离与纯化，最终纯的酵母菌，PCR扩增酵母菌26S rDNA基因D1/D2区，将PCR产物进行回收与克隆，测序后进行blast对比鉴定，根据26S rDNA序列使用邻接法构建系统发育树，结合形态学方法对酵母菌进行鉴定。
1 材料与方法
1．1 材料
1．1．1 实验材料
从江苏省南京市采集的成熟度好的夏黑无籽葡萄进行酵母菌分离与纯化。从中选出菌株共2株，分别为：S2和S5。
1．1．2 培养基
YPD培养基：酵母膏1％(m/v)，蛋白胨2％(m/v)，葡萄糖2％(m/v)，琼脂2％(m/v)，自然pH，121℃灭菌20min。另外加100mg/L氯霉素(抑制其他杂菌)。
PDA培养基：马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂20g，水1000mL，121℃灭菌20min。另外加100mg/L氯霉素(抑制其他杂菌)。
孟加拉红培养基：蛋白胨5g，葡萄糖10g，磷酸二氢钾1g，硫酸镁0.5g，琼脂20g，1/3000孟加拉红溶液100ml，水900ml，氯霉素0.1g。
LB固体培养基：胰蛋白胨 10g，酵母粉 5g，NaCl 10g，琼脂20g，水1000ml，pH 7.2。
LB液体培养基：胰蛋白胨 10g，酵母粉 5g，NaCl 10g，水1000ml，pH 7.2。
1. 1. 3 主要试剂
培养基配制试剂，购自上海沪试试剂器材有限公司；
引物NL1(5’GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG3’)和NL4 (5’GGTCCGTGTTT CAAGACGG3’)，由上海捷瑞生物工程有限公司合成；
E.Z.N.A真菌DNA微量提取试剂盒(D339001)，购自美国Omega公司；
目录
摘要 1
关键词 1
Abstract 1
Key words 1
1 材料与方法 2
1．1 材料 2
1．1．1 实验材料 2
1．1．2 培养基 2
1. 1. 3 主要试剂 2
1. 1. 4 主要仪器 3
1．2 葡萄酵母菌株的分离与保藏 3
1. 2. 1 葡萄酵母菌株的分离 3
1. 2. 2 葡萄酵母菌株的保藏 3
1. 2. 3 葡萄酵母的形态学鉴定 3
1. 3 葡萄酵母菌的分子生物学鉴定 3
1. 3. 1 DNA的提取 3
1. 3. 2 目的基因的PCR扩增 3
1. 3. 3 PCR产物的回收与克隆 3
1. 3. 4 测序及构建系统发育树 4
2 结果与分析 4
2. 1 葡萄酵母菌的分离和筛选 4
2. 2 葡萄酵母菌形态特征 4
2．3 葡萄酵母菌的分子生物学鉴定 5
2. 3. 1 葡萄酵母菌目的基因片段扩增 5
2. 3. 2 测序结果与同源性对比 6
3 讨论 7
致谢 8
参考文献 8
葡萄酵母菌的分离与分子生物学鉴定
引言
葡萄在我国各地均有种植，葡萄果实中含有的各种营养元
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: ￥3^5`1^9`1^6^0`7^2$
素，如维生素，矿物质，碳水化合物，膳食纤维和植物化学成分，可起到抗衰老、抗肿瘤、美容养颜等多种功效。葡萄酒因美味可口、营养丰富、有益于人体健康而越来越受到人们的喜爱和追捧[1]。葡萄酒的酿造过程中，最重要的微生物就是酵母菌，它起着提高产品产量，改善产品质量已经增加风味物质的作用[2]。
在多年栽种葡萄的园区中,有很多种天然酵母菌与其寄主相伴而生,经过长时间的自然选择和演变进化，逐渐孕育了一些适于当地环境条件和葡萄品种的优势天然酵母菌,常在葡萄酒生产过程中中,随同原料参与葡萄酒的酿造过程,对具有不同地域特色的葡萄酒的品质和风格形成发挥了十分重要的作用[3]。
到目前为止，葡萄酒行业已经发展了许多年，但葡萄酒在全球范围内已经出现了“同质化”现象，生产者们正在面临着重大的风险与考验。因此，如何酿造出具有独特风格和特色的葡萄酒已成为一个全球性的课题。从葡萄品种原产地筛选出具有具有当地品种特色的酵母菌已成为科学家们近期研究的一个重要途径和方向，对酿出具有当地特色、又有品种典型性的葡萄酒有很大的帮助[4]。
常规的鉴定酵母菌是通过形态学特征进行鉴定的，通常大家也会使用酵母菌的生理特征进行辅助鉴定。一般情况下，要使用该方法对一株菌株进行鉴定，工作量十分大，消耗时间，并且结果还具有不确定性，其特征容易受到培养环境的影响出现误差[5]。伴随着生物技术的日益发展，使用分子生物学技术对酵母菌进行鉴定的方式已渐渐成为最重要和最常用的方法，主要包括DNA限制性片段多态性分析(PCRRFLP)，核糖体DNA序列分析，脉冲电泳核型分析(PFGE)，随机扩增多态性DNA（RAPD），以及TRFLP、实时PCR技术(RealtimePCR)、DNA重组探针的指纹图谱技术和微卫星分子标记技术等。
Kuttzman&Robnett(1998)测定了大约500种酵母菌的大亚基26S rDNA的D1/D2可变区的序列，发现使用这段序列(500bp600bp)能够将酵母菌属绝大部分的种进行区分，核苷酸序列相差小于1％的一般为同一个种[6]。GUTELL等[7]研究表明，D1/D2这段区域的序列具有较高的差异，可以用于亲缘关系较近的菌株，即种与种相互之间的分类研究。这些序列在像NCBI（National Center for Biotechnoligy Information）等国际核酸序列数据库中均已公布，使得序列的比对更加简便，也更具可行性[8]。
26S rDNA基因D1/D2区序列分析的方法，主要是通过对比26S rDNA的D1/D2区域的序列进行鉴定的。序列分析的主要流程是：提取菌株的基因组DNA，以该DNA为模板使用NL1/NL4为引物PCR扩增相应的区域，使用琼脂糖凝胶检测目的DNA片段，纯化后测序，将得到的序列在数据库中进行比对。碱基之间区别越小的序列相似度就越高，成为该序列所对应菌种的可能性就越大。同时，可以从一些国际数据库中下载一些同源性高的序列，使用软件构建发育树，并进行种属分析。
本实验主要以夏黑无籽葡萄为实验材料，采用梯度稀释法和划线纯化法，对葡萄表面微生物进行分离与纯化，最终纯的酵母菌，PCR扩增酵母菌26S rDNA基因D1/D2区，将PCR产物进行回收与克隆，测序后进行blast对比鉴定，根据26S rDNA序列使用邻接法构建系统发育树，结合形态学方法对酵母菌进行鉴定。
1 材料与方法
1．1 材料
1．1．1 实验材料
从江苏省南京市采集的成熟度好的夏黑无籽葡萄进行酵母菌分离与纯化。从中选出菌株共2株，分别为：S2和S5。
1．1．2 培养基
YPD培养基：酵母膏1％(m/v)，蛋白胨2％(m/v)，葡萄糖2％(m/v)，琼脂2％(m/v)，自然pH，121℃灭菌20min。另外加100mg/L氯霉素(抑制其他杂菌)。
PDA培养基：马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂20g，水1000mL，121℃灭菌20min。另外加100mg/L氯霉素(抑制其他杂菌)。
孟加拉红培养基：蛋白胨5g，葡萄糖10g，磷酸二氢钾1g，硫酸镁0.5g，琼脂20g，1/3000孟加拉红溶液100ml，水900ml，氯霉素0.1g。
LB固体培养基：胰蛋白胨 10g，酵母粉 5g，NaCl 10g，琼脂20g，水1000ml，pH 7.2。
LB液体培养基：胰蛋白胨 10g，酵母粉 5g，NaCl 10g，水1000ml，pH 7.2。
1. 1. 3 主要试剂
培养基配制试剂，购自上海沪试试剂器材有限公司；
引物NL1(5’GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG3’)和NL4 (5’GGTCCGTGTTT CAAGACGG3’)，由上海捷瑞生物工程有限公司合成；
E.Z.N.A真菌DNA微量提取试剂盒(D339001)，购自美国Omega公司；
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