1株海芦笋产油内生真菌发酵条件优化研究
1株海芦笋产油内生真菌发酵条件优化研究[20200509190429]
摘要：微生物油脂又称为单细胞油脂(SCO)，主要是指由霉菌、酵母菌、细菌和藻类在一定的培养条件下，利用培养介质在菌体内合成并积累的油脂，微生物的生长周期短，是一种可再生资源，利用微生物发酵生产油脂日益引起人们的关注。本研究采用单因素实验和正交试验对小克银汉霉产油脂的培养条件进行了优化，包括发酵天数、C/N、无机盐离子种类及其浓度对油脂产量和生物量的影响，通过正交实验确定最佳培养基为：甘露醇20g/L，味精9.55g/L，海水素33g/L，KH2PO40.5g/L，Fe2+0.12g/L ，Ca2+0.08g/L， Mg2+0.30g/L，葡萄糖10g/L，麦芽糖20g/L，酵母膏3g/L，玉米浆1g/L，优化后油脂产量达到1.8g/L，是初始培养基油脂产量的1.8倍，生物量产量达到6.2g/L，是初始培养基生物量产量的1.15倍，油脂产量占生物量的百分数也由18.5%提高到了29.0%。
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: 3_5_1_9_1_6_0_7_2
关键字:小克银汉霉；油脂；优化
目录
摘要 1
关键词 1
Abstract 1
Key word 1
引言 1
1 材料与方法 2
1．1 材料与仪器 2
1．2 试验方法 2
1．2．1 菌种活化 2
1．2．2 发酵培养 2
1．2．3 发酵天数对油脂产量的影响 3
1．2．4 C/N对油脂产量的影响 3
1．2．5 无机盐离子对γ亚麻酸产量的影响 3
1．2．6 正交实验 3
1．2．7 油脂提取和测定 3
1．2．8 生物量测定 3
2 结果与分析 3
2．1 菌株发酵条件的优化 3
2．1．1 发酵天数对油脂产量的影响 4
2．1．2 C/N对油脂产量的影响 5
2．1．3 无机盐离子以及浓度对油脂产量的影响 5
2．1．4 正交实验 7
3 讨论 8
致谢 8
参考文献: 9
1株海芦笋产油内生真菌发酵条件优化研究
引言
引言微生物油脂又称单细胞油脂( SCO) , 是由酵母、霉菌、细菌和藻类等微生物在一定条件下, 利用碳水化合物、碳氢化合物和普通油脂作为碳源,氮源,辅以无机盐在菌体内产生的油脂，以真菌微生物生产的油脂为真菌油脂[1]。和动植物油脂一样，真菌油脂主要以两种形式存在，一种是体质脂形式，主要作为细胞的结构组成部分而存在于细胞中，此类脂质在真菌中含量非常恒定；另一种以贮存脂形式存在，油脂以脂滴或油脂粒形式贮存于细胞质中，此类脂质在真菌中含量因菌种而异，即使同一菌 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: 3_5_1_9_1_6_0_7_2
株在不同的生长阶段和不同的培养条件下也会发生较大的差异，一般认为此类脂质的主要生理作用是作为能量储存物质，而多不饱和脂肪酸类与菌体的抗逆性(如低温)以及其他的一些特性有关。产油酵母菌和霉菌合成的油脂主要是甘油脂和磷脂,甘油脂约占80%以上,磷脂约占10%以上"磷脂主要含有磷脂酞胆碱,磷脂酞乙醇胺,磷脂酞丝氨酸等"[2]。
目前, 利用丝状真菌生产微生物油脂的研究很多, 丝状真菌中含有丰富的多不饱和脂肪酸( PUFA s) , 多不饱和脂肪酸主要是指亚油酸( LA) 、α-亚麻酸(ALA)、γ-亚麻酸( GLA) 、花生四烯酸( ARA ) 、二十碳五烯酸( EPA) 和二十二碳六烯酸( DHA) 等，这些多不饱和脂肪酸已被证实的生理功能有诸如治疗和预防高血压、心脏病和某些癌症, 改善糖尿病并发症，降低胆固醇，降血脂，抗动脉粥样硬化作用，抗菌、抗HW作用，对类风湿性关节炎、肠炎、脉管炎、肾炎等多种炎症均具有疗效或改善作用，此外还具有改善记忆力和睡眠效果，减肥等等重要的保健功能还有美容、化妆品方面的应用，其中有些不饱和脂肪酸是大脑和神经系统不可缺少的营养物质, 是大脑发育过程中的必需脂肪酸[3, 4]。由于多不饱和脂肪酸油脂在陆地动植物中含量较少, 一般在月见草、夜来香中可以提取GLA,在深海鱼油中制取EPA和DHA, 目前多不饱和脂肪酸油脂产品的主要原料来源是深海鱼油, 其稳定性差, 且受季节、产地等因素影响, 因此价格比较昂贵[5]。而微生物油脂可克服上述缺点, 它不受季节影响, 质量较为稳定, 生产期短, 精制成本低, 可进行大规模生产[6, 7]。随着人口的增多和资源的不足, 利用微生物来合成脂肪酸油脂变得越来越受人们瞩目, 这方面的研究已成为近年来的一个热门课题。产油微生物具有资源丰富、油脂含量高、碳源利用谱广等特点,开发潜力大,所以微生物油脂具有良好的发展前景,开辟微生物油脂这一新的油脂资源的研究开发领域将是工业化生产油脂的一个重要途径。丝状真菌油脂含量高，且油脂中的 γ-亚麻酸、花生四烯酸等功能性多不饱和脂肪酸含量较酵母菌、细菌和藻类生产的油脂含量更高，因而被越来越广泛深入地研究。小克银汉霉菌发酵产物由菌体干重、油脂含量几部分共同决定, 一个因素的提高却可能导致最终产量下降, 因而对其发酵条件要全面考虑[8]。
本研究主要以一株编号为Salicorn 5小克银汉霉菌为研究对象（是于野生盐生海芦笋中分离到的一株产油内生真菌），以油脂产量和生物量为研究指标，利用单因素实验对其发酵参数进行筛选, 包括考察不同发酵天数、C/N、无机盐离子等参数对小克银汉霉产油脂的影响；该研究旨在提高产油真菌Salicorn 5的生物量和油脂产量。
1 材料与方法
1．1 材料与仪器
小克银汉霉菌（Cunninghamella sp.）Salicorn 5已在中国普通微生物菌种保藏管理中心（CGMCC）保藏
EYELAN-N型旋转薄膜蒸发仪 日本Rikakikai 有限公司；EYELA油浴锅 上海爱朗仪器有限公司；THZ-D台式恒温振荡器 日本高崎科学器械株式会社；洁净工作台 苏净集团安泰公司;LDZX-50KBS立式压力蒸汽灭菌器 江苏太仓市实验设备厂；HN101-1A鼓风干燥箱 上海苏进仪器设备厂监制；SW-CJ-1FD型单人单面净化工作台；K3102电子天平 浙江凯丰 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: 3_5_1_9_1_6_0_7_2
集团有限公司;分液漏斗;真空泵
斜面保藏培养基 采用PDA固体培养基，配方为：土豆200g/L、葡萄糖20g/L、琼脂20g/L、食盐30g/L，蒸馏水配制。
初始发酵培养基配方（g/L）：甘露醇20、味精10、海水素33、KH2PO4 0.5、MgSO47H2O 0.3、葡萄糖10、麦芽糖20、酵母膏3、玉米浆1。pH6.5，装液量100 mL/ 500mL，121℃灭菌30min。
1．2 试验方法
1．2．1 菌种活化 在无菌条件下，从实验室保藏的固体斜面培养基用接种环刮取菌体，接种于121℃经过30min灭菌后的PDA平板培养基中, 经28℃培养3d活化。将斜面培养物放置4℃ 下冰箱中保存。
1．2．2 发酵培养 在无菌条件下，将活化后的菌种接种至装有100mL发酵培养基的500mL三角瓶中，每瓶接种两到三次，接种后在28℃、120r/min的条件下摇床培养。
1．2．3 发酵天数对油脂产量的影响 改变发酵天数，分别以3d、4d、5d、6d、7d培养，考察不同发酵天数对油脂产量、生物量的影响，确定油脂产量最大的天数。
1．2．4 C/N对油脂产量的影响 通过改变氮源来源味精的含量不改变其他碳源的含量而改变初始发酵培养基的C/N，分别以15.62、9.55、6.88、5.37gg/L的味精浓度加入初始培养基，考察不同C/N对油脂产量、生物量的影响。
1．2．5 无机盐离子对γ亚麻酸产量的影响 分别以不同浓度梯度的Mg2+、Fe2+、Ca2+添加到初始培养基里以考察这三种离子对油脂产量、生物量的影响。Mg2+加入量分别为 0.10、0.20、0.30、0.40g/L,Fe2+加入量分别为0.04、0.08、0.12、0.16g/L，Ca2+加入量分别为 0.04、0.08、0.12、0.16g/L。 Fe2+来源是FeSO47H2O、Ca2+来源是CaCl2 、Mg2+来源是MgSO47H2O。
摘要：微生物油脂又称为单细胞油脂(SCO)，主要是指由霉菌、酵母菌、细菌和藻类在一定的培养条件下，利用培养介质在菌体内合成并积累的油脂，微生物的生长周期短，是一种可再生资源，利用微生物发酵生产油脂日益引起人们的关注。本研究采用单因素实验和正交试验对小克银汉霉产油脂的培养条件进行了优化，包括发酵天数、C/N、无机盐离子种类及其浓度对油脂产量和生物量的影响，通过正交实验确定最佳培养基为：甘露醇20g/L，味精9.55g/L，海水素33g/L，KH2PO40.5g/L，Fe2+0.12g/L ，Ca2+0.08g/L， Mg2+0.30g/L，葡萄糖10g/L，麦芽糖20g/L，酵母膏3g/L，玉米浆1g/L，优化后油脂产量达到1.8g/L，是初始培养基油脂产量的1.8倍，生物量产量达到6.2g/L，是初始培养基生物量产量的1.15倍，油脂产量占生物量的百分数也由18.5%提高到了29.0%。
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关键字:小克银汉霉；油脂；优化
目录
摘要 1
关键词 1
Abstract 1
Key word 1
引言 1
1 材料与方法 2
1．1 材料与仪器 2
1．2 试验方法 2
1．2．1 菌种活化 2
1．2．2 发酵培养 2
1．2．3 发酵天数对油脂产量的影响 3
1．2．4 C/N对油脂产量的影响 3
1．2．5 无机盐离子对γ亚麻酸产量的影响 3
1．2．6 正交实验 3
1．2．7 油脂提取和测定 3
1．2．8 生物量测定 3
2 结果与分析 3
2．1 菌株发酵条件的优化 3
2．1．1 发酵天数对油脂产量的影响 4
2．1．2 C/N对油脂产量的影响 5
2．1．3 无机盐离子以及浓度对油脂产量的影响 5
2．1．4 正交实验 7
3 讨论 8
致谢 8
参考文献: 9
1株海芦笋产油内生真菌发酵条件优化研究
引言
引言微生物油脂又称单细胞油脂( SCO) , 是由酵母、霉菌、细菌和藻类等微生物在一定条件下, 利用碳水化合物、碳氢化合物和普通油脂作为碳源,氮源,辅以无机盐在菌体内产生的油脂，以真菌微生物生产的油脂为真菌油脂[1]。和动植物油脂一样，真菌油脂主要以两种形式存在，一种是体质脂形式，主要作为细胞的结构组成部分而存在于细胞中，此类脂质在真菌中含量非常恒定；另一种以贮存脂形式存在，油脂以脂滴或油脂粒形式贮存于细胞质中，此类脂质在真菌中含量因菌种而异，即使同一菌 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: 3_5_1_9_1_6_0_7_2
株在不同的生长阶段和不同的培养条件下也会发生较大的差异，一般认为此类脂质的主要生理作用是作为能量储存物质，而多不饱和脂肪酸类与菌体的抗逆性(如低温)以及其他的一些特性有关。产油酵母菌和霉菌合成的油脂主要是甘油脂和磷脂,甘油脂约占80%以上,磷脂约占10%以上"磷脂主要含有磷脂酞胆碱,磷脂酞乙醇胺,磷脂酞丝氨酸等"[2]。
目前, 利用丝状真菌生产微生物油脂的研究很多, 丝状真菌中含有丰富的多不饱和脂肪酸( PUFA s) , 多不饱和脂肪酸主要是指亚油酸( LA) 、α-亚麻酸(ALA)、γ-亚麻酸( GLA) 、花生四烯酸( ARA ) 、二十碳五烯酸( EPA) 和二十二碳六烯酸( DHA) 等，这些多不饱和脂肪酸已被证实的生理功能有诸如治疗和预防高血压、心脏病和某些癌症, 改善糖尿病并发症，降低胆固醇，降血脂，抗动脉粥样硬化作用，抗菌、抗HW作用，对类风湿性关节炎、肠炎、脉管炎、肾炎等多种炎症均具有疗效或改善作用，此外还具有改善记忆力和睡眠效果，减肥等等重要的保健功能还有美容、化妆品方面的应用，其中有些不饱和脂肪酸是大脑和神经系统不可缺少的营养物质, 是大脑发育过程中的必需脂肪酸[3, 4]。由于多不饱和脂肪酸油脂在陆地动植物中含量较少, 一般在月见草、夜来香中可以提取GLA,在深海鱼油中制取EPA和DHA, 目前多不饱和脂肪酸油脂产品的主要原料来源是深海鱼油, 其稳定性差, 且受季节、产地等因素影响, 因此价格比较昂贵[5]。而微生物油脂可克服上述缺点, 它不受季节影响, 质量较为稳定, 生产期短, 精制成本低, 可进行大规模生产[6, 7]。随着人口的增多和资源的不足, 利用微生物来合成脂肪酸油脂变得越来越受人们瞩目, 这方面的研究已成为近年来的一个热门课题。产油微生物具有资源丰富、油脂含量高、碳源利用谱广等特点,开发潜力大,所以微生物油脂具有良好的发展前景,开辟微生物油脂这一新的油脂资源的研究开发领域将是工业化生产油脂的一个重要途径。丝状真菌油脂含量高，且油脂中的 γ-亚麻酸、花生四烯酸等功能性多不饱和脂肪酸含量较酵母菌、细菌和藻类生产的油脂含量更高，因而被越来越广泛深入地研究。小克银汉霉菌发酵产物由菌体干重、油脂含量几部分共同决定, 一个因素的提高却可能导致最终产量下降, 因而对其发酵条件要全面考虑[8]。
本研究主要以一株编号为Salicorn 5小克银汉霉菌为研究对象（是于野生盐生海芦笋中分离到的一株产油内生真菌），以油脂产量和生物量为研究指标，利用单因素实验对其发酵参数进行筛选, 包括考察不同发酵天数、C/N、无机盐离子等参数对小克银汉霉产油脂的影响；该研究旨在提高产油真菌Salicorn 5的生物量和油脂产量。
1 材料与方法
1．1 材料与仪器
小克银汉霉菌（Cunninghamella sp.）Salicorn 5已在中国普通微生物菌种保藏管理中心（CGMCC）保藏
EYELAN-N型旋转薄膜蒸发仪 日本Rikakikai 有限公司；EYELA油浴锅 上海爱朗仪器有限公司；THZ-D台式恒温振荡器 日本高崎科学器械株式会社；洁净工作台 苏净集团安泰公司;LDZX-50KBS立式压力蒸汽灭菌器 江苏太仓市实验设备厂；HN101-1A鼓风干燥箱 上海苏进仪器设备厂监制；SW-CJ-1FD型单人单面净化工作台；K3102电子天平 浙江凯丰 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: 3_5_1_9_1_6_0_7_2
集团有限公司;分液漏斗;真空泵
斜面保藏培养基 采用PDA固体培养基，配方为：土豆200g/L、葡萄糖20g/L、琼脂20g/L、食盐30g/L，蒸馏水配制。
初始发酵培养基配方（g/L）：甘露醇20、味精10、海水素33、KH2PO4 0.5、MgSO47H2O 0.3、葡萄糖10、麦芽糖20、酵母膏3、玉米浆1。pH6.5，装液量100 mL/ 500mL，121℃灭菌30min。
1．2 试验方法
1．2．1 菌种活化 在无菌条件下，从实验室保藏的固体斜面培养基用接种环刮取菌体，接种于121℃经过30min灭菌后的PDA平板培养基中, 经28℃培养3d活化。将斜面培养物放置4℃ 下冰箱中保存。
1．2．2 发酵培养 在无菌条件下，将活化后的菌种接种至装有100mL发酵培养基的500mL三角瓶中，每瓶接种两到三次，接种后在28℃、120r/min的条件下摇床培养。
1．2．3 发酵天数对油脂产量的影响 改变发酵天数，分别以3d、4d、5d、6d、7d培养，考察不同发酵天数对油脂产量、生物量的影响，确定油脂产量最大的天数。
1．2．4 C/N对油脂产量的影响 通过改变氮源来源味精的含量不改变其他碳源的含量而改变初始发酵培养基的C/N，分别以15.62、9.55、6.88、5.37gg/L的味精浓度加入初始培养基，考察不同C/N对油脂产量、生物量的影响。
1．2．5 无机盐离子对γ亚麻酸产量的影响 分别以不同浓度梯度的Mg2+、Fe2+、Ca2+添加到初始培养基里以考察这三种离子对油脂产量、生物量的影响。Mg2+加入量分别为 0.10、0.20、0.30、0.40g/L,Fe2+加入量分别为0.04、0.08、0.12、0.16g/L，Ca2+加入量分别为 0.04、0.08、0.12、0.16g/L。 Fe2+来源是FeSO47H2O、Ca2+来源是CaCl2 、Mg2+来源是MgSO47H2O。
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