生物发酵法研制无硝捆蹄甘蓝替代
目 录
1 引言 1
1.1 亚硝酸盐的作用 1
1.2 亚硝酸盐的危害 2
1.3 亚硝酸盐的替代方法 2
1.4 亚硝酸盐的研究现状 2
1.5 本课题的研究目的及意义 3
2 材料和方法 3
2.1 实验材料 3
2.2 实验试剂 3
2.3 实验仪器 4
2.4 实验方法 4
3 结论与讨论 9
3.1 甘蓝中亚硝酸盐的测定 9
3.2 菌种生理生化特性的测定 9
3.3 生产因素对硝酸盐还原酶活性的影响 11
3.4 发酵液中亚硝酸盐含量的测定 15
3.5 无硝捆蹄的分析检测 16
结 论 19
致 谢 20
参 考 文 献 21
1 引言
作为淮扬菜系的一道极具特色的佐餐佳肴,淮安高沟捆蹄已经具有百年的历
史。食品添加剂的种类有很多，亚硝酸盐就是很常见的一种，在捆蹄生产过程中会加入适量的亚硝酸盐，亚硝酸盐在保持捆蹄色香味的同时也延缓了捆蹄的贮存期。同时亚硝酸盐也是一种潜在的致癌物质[1]。本课题以亚硝酸盐为研究对象，通过生物发酵法，将甘蓝自身的硝酸盐转化成亚硝酸盐，通过研究硝酸盐转化为亚硝酸盐的适宜发酵条件生产无硝捆蹄。
1.1 亚硝酸盐的作用
1.1.1 发色作用
肉制品在加工时先进行腌制，在腌渍的过程中加入的食盐会加快氧化肉中的肌红蛋白和血红蛋白，从而产生高铁肌红蛋白和高铁血红蛋白，这样肉就会失去其本身的色泽，变成灰红色，给人带来一种肉变质的感觉，导致肉制品的外 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: %3^5`1^9`1^6^0`7^2#
表品质和食用价值降低。一般肌红蛋白在肉制品中一般表现为还原状态，性质很不稳定，原本的暗紫色被氧化后极易变成鲜红色。其作用机理在于这种被氧化后的还原态肌红蛋白分子中含有Fe2+，而这种Fe2+上的结晶水会因分子状态的氧的氧化而反应生成氧合肌红蛋白，其颜色就会变成肉红色。当其存在于有氧化物质环境中的时候，这种氧合肌红蛋白将Fe2+氧化成Fe3+，Fe3+颜色表现为红褐色。因此在这种情况下，氧合肌红蛋白就会进行氧化反应，从而转变成高铁肌红蛋白。同时，NO也能被还原型肌红蛋白氧化转变成为亚硝基肌红蛋白，所转变生成的这种化合物在高温环境下会释放出巯基生成相对而言比较稳定的亚硝基血色原，这种化合物是鲜红色的，能给肉呈现出一种特有的肉红色。Vc能使肉制品形成更加稳定的色泽，其原理在于其可以防止NO、肌红蛋白被氧气氧化的更多。所以在腌制的过程中添加适量的亚硝酸盐可以使肉制品保持独特、稳定的色泽[2]，进一步提高食用者对肉制品的食用感，增加其商业价值。
1.1.2 抑菌作用
亚硝酸盐在肉制品生产过程中起到抑菌作用，尤其是对一些常见的致病菌，在一定程度上亚硝酸盐对那些常见的致病菌的生长繁殖起抑制作用。限制亚硝酸盐抑菌能力的原因有很多，例如残留在终产品中亚硝酸盐的数量、亚硝酸盐生存环境的pH和温度等[3]。
1.1.3 增强风味
肌红蛋白细胞的渗透压在亚硝酸盐与食盐发生反应后升高，导致盐腌制过程中的渗透力得到增强，?能快速赋予肉制品成熟的风味[4]，赋予其较好的弹性和粘性，能去除原料肉自身的腥味，保持优异的口感，提高终产品质量。
1.1.4 抗氧化作用
亚硝酸盐是一种螯合剂，在原料肉进行腌渍时，亚硝酸盐能使泡胀的胶原蛋白的数量增多，使肉更具有黏度和弹力[5]，从而可以防止肉制品在有氧化物质的环境中被氧化，导致快速变质。
1.2 亚硝酸盐的危害
一旦食用亚硝酸盐量过多，而这些多余的亚硝酸盐让机体无法承受，不能及时分解转化，这些未转化的亚硝酸盐就会被吸收进入人体血液。亚硝酸盐本身具有还原能力，能使血红蛋白中的Fe2+快速转化为Fe3+，氧化为高铁血红蛋白，不断升高高铁血红蛋白的数量，最终引起血红蛋白携带氧气的功能消失。同时正常血红蛋白释放氧的功能减弱，引起机体功能缺氧，引发一系列不良反应如呼吸衰竭、皮肤颜色变紫、血压急剧下降等，反应剧烈的可能会发生抽筋、大小便失禁、昏迷、呼吸困难等症状[6]。亚硝酸盐不稳定，在酸性条件下会容易形成HNO2，HNO2性质很不稳定，极易变成HNO2。而HNO2会与机体内的胺类物质发生反应生成NH4NO2。通过大量文献证明，NH4NO2对人体具有癌变、畸形、基因发生改变的潜在危害。而且人体胃液中偏低的pH值环境正好有利于产生NH4NO2，因此人体每天吸收多少亚硝酸盐需引起重视。另外，食用过量的亚硝酸盐会使碘的代谢功能减弱，导致甲状腺摄取碘的能力下降，造成甲状腺肿大；还会减弱血管的平滑肌的紧凑性，使血管末梢松弛扩大导致血液外周循环衰竭。
由于亚硝酸盐可能会引起机体发生癌变，所以机体在吸收了超过规定的亚硝酸盐后可能会得各类癌症，严重影响人体的健康。所以，国家在亚硝酸盐添加到食物中的量和食物终产品中残留数目上有强制性的规定。食品添加剂的使用数量在我国有很严格的限制，在生产过程中亚硝酸盐在每千克肉制品中添 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: %3^5`1^9`1^6^0`7^2#
加量不允许超过150毫克，亚硝酸盐残留在每千克肉制品中不允许超过50毫克[7]。
1.3 亚硝酸盐的替代方法
目前使用的亚硝酸盐替代品有两类：一类是直接取代亚硝酸盐的作用，这类物质一般分别由起发色作用的物质、抗氧化作用的物质、螯合作用的物质和抑制致病菌生长繁殖的物质组成；另一类是间接取代亚硝酸盐，机理在于亚硝酸盐在一般浓度下，这类物质能够抑制NH4NO2的生成 [8]。目前的研究表明，还没有能够代替亚硝酸盐在肉制品中发挥的所有作用。通过查阅大量文献可以发现目前亚硝酸盐在肉制品腌制过程中的替代品系统主要有红曲霉色素和抗坏血酸-葡萄糖系统替代亚硝酸盐的发色作用，乳酸链球菌素能替代亚硝酸盐的抑菌作用等。
1.4 亚硝酸盐的研究现状
各种研究表明，迄今为止还没有一种物质能代替亚硝酸盐在肉制品加工生产过程
中表现的所有作用。生物发酵法替代亚硝酸盐在研究历史上是一种比较先进的工艺，主要利用微生物发酵，制备发酵液代替化学合成的亚硝酸盐，目前已确定的菌株主要有葡萄球菌和乳酸菌 [9]。一般肉制品中多的是葡萄球菌，葡萄球菌利用其硝酸盐还原酶活性在肉制品腌制过程中能生成蛋白酶、脂酶，降解蛋白质和脂类，使肉产品拥有特殊的味道[10]。本文旨在研究利用肉糖葡萄球菌和木糖葡萄球菌来替代亚硝酸盐。众所周知，蔬菜是一种易于富集硝酸盐的植物性食物，在肉制品腌制过程中加入蔬菜粉来替代化学合成的亚硝酸盐，增加肉制品中膳食纤维等营养元素的价值[11]。本文选用甘蓝作为原材料，在生产过程中利用肉葡萄球菌和木糖葡萄球菌发酵甘蓝粉制备发酵液，讨论分析甘蓝粉中硝酸盐还原为亚硝酸盐的适宜发酵条件，这种工艺既减少了直接添加亚硝酸盐所产生的危害，又能生产出与直接添加亚硝酸盐时具有相同色香味和组织形态的捆蹄。
2.3 实验仪器
名称 型号 生产厂家
2.4.4 无硝捆蹄的分析检测
2.4.4.1 亚硝酸盐含量
的菌悬液OD600值，得到不同NaNO2浓度下菌种吸光度值的变化，如图4所示。
1 引言 1
1.1 亚硝酸盐的作用 1
1.2 亚硝酸盐的危害 2
1.3 亚硝酸盐的替代方法 2
1.4 亚硝酸盐的研究现状 2
1.5 本课题的研究目的及意义 3
2 材料和方法 3
2.1 实验材料 3
2.2 实验试剂 3
2.3 实验仪器 4
2.4 实验方法 4
3 结论与讨论 9
3.1 甘蓝中亚硝酸盐的测定 9
3.2 菌种生理生化特性的测定 9
3.3 生产因素对硝酸盐还原酶活性的影响 11
3.4 发酵液中亚硝酸盐含量的测定 15
3.5 无硝捆蹄的分析检测 16
结 论 19
致 谢 20
参 考 文 献 21
1 引言
作为淮扬菜系的一道极具特色的佐餐佳肴,淮安高沟捆蹄已经具有百年的历
史。食品添加剂的种类有很多，亚硝酸盐就是很常见的一种，在捆蹄生产过程中会加入适量的亚硝酸盐，亚硝酸盐在保持捆蹄色香味的同时也延缓了捆蹄的贮存期。同时亚硝酸盐也是一种潜在的致癌物质[1]。本课题以亚硝酸盐为研究对象，通过生物发酵法，将甘蓝自身的硝酸盐转化成亚硝酸盐，通过研究硝酸盐转化为亚硝酸盐的适宜发酵条件生产无硝捆蹄。
1.1 亚硝酸盐的作用
1.1.1 发色作用
肉制品在加工时先进行腌制，在腌渍的过程中加入的食盐会加快氧化肉中的肌红蛋白和血红蛋白，从而产生高铁肌红蛋白和高铁血红蛋白，这样肉就会失去其本身的色泽，变成灰红色，给人带来一种肉变质的感觉，导致肉制品的外 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: %3^5`1^9`1^6^0`7^2#
表品质和食用价值降低。一般肌红蛋白在肉制品中一般表现为还原状态，性质很不稳定，原本的暗紫色被氧化后极易变成鲜红色。其作用机理在于这种被氧化后的还原态肌红蛋白分子中含有Fe2+，而这种Fe2+上的结晶水会因分子状态的氧的氧化而反应生成氧合肌红蛋白，其颜色就会变成肉红色。当其存在于有氧化物质环境中的时候，这种氧合肌红蛋白将Fe2+氧化成Fe3+，Fe3+颜色表现为红褐色。因此在这种情况下，氧合肌红蛋白就会进行氧化反应，从而转变成高铁肌红蛋白。同时，NO也能被还原型肌红蛋白氧化转变成为亚硝基肌红蛋白，所转变生成的这种化合物在高温环境下会释放出巯基生成相对而言比较稳定的亚硝基血色原，这种化合物是鲜红色的，能给肉呈现出一种特有的肉红色。Vc能使肉制品形成更加稳定的色泽，其原理在于其可以防止NO、肌红蛋白被氧气氧化的更多。所以在腌制的过程中添加适量的亚硝酸盐可以使肉制品保持独特、稳定的色泽[2]，进一步提高食用者对肉制品的食用感，增加其商业价值。
1.1.2 抑菌作用
亚硝酸盐在肉制品生产过程中起到抑菌作用，尤其是对一些常见的致病菌，在一定程度上亚硝酸盐对那些常见的致病菌的生长繁殖起抑制作用。限制亚硝酸盐抑菌能力的原因有很多，例如残留在终产品中亚硝酸盐的数量、亚硝酸盐生存环境的pH和温度等[3]。
1.1.3 增强风味
肌红蛋白细胞的渗透压在亚硝酸盐与食盐发生反应后升高，导致盐腌制过程中的渗透力得到增强，?能快速赋予肉制品成熟的风味[4]，赋予其较好的弹性和粘性，能去除原料肉自身的腥味，保持优异的口感，提高终产品质量。
1.1.4 抗氧化作用
亚硝酸盐是一种螯合剂，在原料肉进行腌渍时，亚硝酸盐能使泡胀的胶原蛋白的数量增多，使肉更具有黏度和弹力[5]，从而可以防止肉制品在有氧化物质的环境中被氧化，导致快速变质。
1.2 亚硝酸盐的危害
一旦食用亚硝酸盐量过多，而这些多余的亚硝酸盐让机体无法承受，不能及时分解转化，这些未转化的亚硝酸盐就会被吸收进入人体血液。亚硝酸盐本身具有还原能力，能使血红蛋白中的Fe2+快速转化为Fe3+，氧化为高铁血红蛋白，不断升高高铁血红蛋白的数量，最终引起血红蛋白携带氧气的功能消失。同时正常血红蛋白释放氧的功能减弱，引起机体功能缺氧，引发一系列不良反应如呼吸衰竭、皮肤颜色变紫、血压急剧下降等，反应剧烈的可能会发生抽筋、大小便失禁、昏迷、呼吸困难等症状[6]。亚硝酸盐不稳定，在酸性条件下会容易形成HNO2，HNO2性质很不稳定，极易变成HNO2。而HNO2会与机体内的胺类物质发生反应生成NH4NO2。通过大量文献证明，NH4NO2对人体具有癌变、畸形、基因发生改变的潜在危害。而且人体胃液中偏低的pH值环境正好有利于产生NH4NO2，因此人体每天吸收多少亚硝酸盐需引起重视。另外，食用过量的亚硝酸盐会使碘的代谢功能减弱，导致甲状腺摄取碘的能力下降，造成甲状腺肿大；还会减弱血管的平滑肌的紧凑性，使血管末梢松弛扩大导致血液外周循环衰竭。
由于亚硝酸盐可能会引起机体发生癌变，所以机体在吸收了超过规定的亚硝酸盐后可能会得各类癌症，严重影响人体的健康。所以，国家在亚硝酸盐添加到食物中的量和食物终产品中残留数目上有强制性的规定。食品添加剂的使用数量在我国有很严格的限制，在生产过程中亚硝酸盐在每千克肉制品中添 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: %3^5`1^9`1^6^0`7^2#
加量不允许超过150毫克，亚硝酸盐残留在每千克肉制品中不允许超过50毫克[7]。
1.3 亚硝酸盐的替代方法
目前使用的亚硝酸盐替代品有两类：一类是直接取代亚硝酸盐的作用，这类物质一般分别由起发色作用的物质、抗氧化作用的物质、螯合作用的物质和抑制致病菌生长繁殖的物质组成；另一类是间接取代亚硝酸盐，机理在于亚硝酸盐在一般浓度下，这类物质能够抑制NH4NO2的生成 [8]。目前的研究表明，还没有能够代替亚硝酸盐在肉制品中发挥的所有作用。通过查阅大量文献可以发现目前亚硝酸盐在肉制品腌制过程中的替代品系统主要有红曲霉色素和抗坏血酸-葡萄糖系统替代亚硝酸盐的发色作用，乳酸链球菌素能替代亚硝酸盐的抑菌作用等。
1.4 亚硝酸盐的研究现状
各种研究表明，迄今为止还没有一种物质能代替亚硝酸盐在肉制品加工生产过程
中表现的所有作用。生物发酵法替代亚硝酸盐在研究历史上是一种比较先进的工艺，主要利用微生物发酵，制备发酵液代替化学合成的亚硝酸盐，目前已确定的菌株主要有葡萄球菌和乳酸菌 [9]。一般肉制品中多的是葡萄球菌，葡萄球菌利用其硝酸盐还原酶活性在肉制品腌制过程中能生成蛋白酶、脂酶，降解蛋白质和脂类，使肉产品拥有特殊的味道[10]。本文旨在研究利用肉糖葡萄球菌和木糖葡萄球菌来替代亚硝酸盐。众所周知，蔬菜是一种易于富集硝酸盐的植物性食物，在肉制品腌制过程中加入蔬菜粉来替代化学合成的亚硝酸盐，增加肉制品中膳食纤维等营养元素的价值[11]。本文选用甘蓝作为原材料，在生产过程中利用肉葡萄球菌和木糖葡萄球菌发酵甘蓝粉制备发酵液，讨论分析甘蓝粉中硝酸盐还原为亚硝酸盐的适宜发酵条件，这种工艺既减少了直接添加亚硝酸盐所产生的危害，又能生产出与直接添加亚硝酸盐时具有相同色香味和组织形态的捆蹄。
2.3 实验仪器
名称 型号 生产厂家
2.4.4 无硝捆蹄的分析检测
2.4.4.1 亚硝酸盐含量
的菌悬液OD600值，得到不同NaNO2浓度下菌种吸光度值的变化，如图4所示。
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