急性蔗糖灌胃对小鼠十二指肠味觉相关基因表达的影响
急性蔗糖灌胃对小鼠十二指肠味觉相关基因表达的影响[20200408174145]
摘要
目的:以一定浓度的蔗糖溶液（12mM/L 或125mM/L）对小鼠进行急性灌胃，观察其对小鼠十二指肠味觉相关基因表达的影响。方法:将小鼠分为对照组（去离子水灌胃）和实验组（不同浓度的蔗糖溶液灌胃）。利用RT-PCR技术检测各组灌胃后不同时间点十二指肠组织味觉相关基因（Cb1、Ob-rb、T1r3、Trpm5）的表达变化。结果: 与对照组相比，蔗糖溶液灌胃影响十二指肠Ob-rb mRNA的表达，主要表现为表达高峰后移:对照组为1h,而蔗糖灌胃组为6h。 蔗糖灌胃组的Trpm5 mRNA的表达变化与对照组基本一致：先下降后上升，低谷在3h，高峰值在24h；并且在灌胃后的同一时间点组间均没有显著性差异。此外，去离子水或蔗糖溶液灌胃对十二指肠Cb1和T1r3 mRNA的表达在24h内均没有显著影响。结论：蔗糖溶液急性灌胃影响十二指肠 Ob-rb mRNA的表达，可能与肠道甜味敏感性改变、胃肠激素分泌以及摄食调节相关。
*查看完整论文请 +Q: 3 5 1 9 1 6 0 7 2
关键字:ICR小鼠急性蔗糖灌胃十二指肠表达水平Effectsofacutesucrosebygavageontheexpressionofassociatedgeneinmouseduodenaltaste
目 录
1.引言 1
1.1 研究背景 1
1.1.1 甜味感受器 1
1.1.2 甜味受体 1
1.1.3 甜味信号转导 2
1.1.4 肠道中甜味的表达 3
1.1.5 甜味剂选择 4
1.1.6 十二指肠及味觉相关基因简介 4
1.2 研究目的 5
1.3 研究内容 5
1.4 研究意义 6
2.实验材料和方法 7
2.1 实验对象及环境 7
2.1.1 雄性ICR小鼠 7
2.1.2 小鼠饲养环境 7
2.2实验试剂和仪器 7
2.2.1实验试剂: 7
2.2.2 实验仪器： 7
2.3实验设计与方法: 8
2.3.1实验设计路线 8
2.3.2实时定量PCR（RT-PCR） 8
2.3.3数据记录与处理 10
3.结果 11
3.1蔗糖灌胃对十二指肠Cb1 mRNA表达量的影响 11
3.2蔗糖灌胃对十二指肠Ob-rb mRNA的表达水平的影响 12
3.3蔗糖灌胃对十二指肠Trpm5 mRNA的表达水平的影响 13
3.4蔗糖灌胃对十二指肠T1r3 mRNA表达量的影响 14
4.讨 论 15
参考文献 17
附 录 18
致 谢 20
1.引言
1.1 研究背景
1.1.1 甜味感受器
最新研究显示，除了5种基本味觉外，脂肪味也是基本味觉之一，还有二价阳离子产生的金属味等等。但目前来看，甜味仍是最重要的味觉，它能激起强烈的摄食欲望。人类的味觉感受器是味蕾，它主要存在于口腔的舌面、软腭、咽部粘膜等处。味蕾是由味蕾细胞组成的，数量一般是50~100个，这些细胞可分为4类，其分类依据是根据其超微结构，可以分为暗细胞（Ⅰ型）、亮细胞（Ⅱ型）、基细胞及干细胞（Ⅲ型）[6]。暗细胞与亮细胞都是味觉感受细胞，由延伸的传入神经纤维支配，在其基底面存在大量的突触能够感受味觉信息[6]。Ⅲ型细胞含有突触，表达电压门控钙离子通道、突触相关蛋白和神经细胞黏附分子等与神经传递相关的蛋白质，可以将感受到的味觉相关刺激直接传导至神经纤维上，并逐级经脑干向上传递至味觉中枢进行信号处理，最终引起味觉的适应性反应[5]。
1.1.2 甜味受体
糖、甜味蛋白、氨基酸和二肽等都是自然界中能够产生甜味的物质。味觉受体第一家族成员中的T1R2和T1R3都属于甜味受体，它们共同表达于舌的轮廓乳头和叶状乳头的味觉受体细胞中 [17]，并且以聚合物形式发挥作用。T1R3会在舌及腭上皮的某些区域的味觉受体细胞中单独表达，这类细胞可以对高浓度的天然甜味剂产生反应[17]。
引起甜味的所有化合物会结合并约束到T1R2和T1R3受体上，但不是所有的甜味剂都会在受体上的相同的位置结合。甜味受体包含了许多甜味剂和甜味测试抑制剂的结合位点。每一个T1R的副族都由3个主要的领域组成，分别是一个在末端的位于细胞外的VFT领域、一个在羧基端的七个横跨细胞膜的领域和一个富含半胱氨酸的链接物。自然的和人工的糖例如蔗糖、葡萄糖和蔗糖素，它们结合在T1R1和T1R3的VFT领域；但是，二肽甜味剂例如阿斯巴甜和纽甜只结合在T1R2的VFT领域。糖精结合囊位于T1R3的七个横跨细胞膜的领域，并且由于甜味抑制剂而紧密的联系在结合位置上。甜味蛋白例如竹芋蛋白和应乐果甜蛋白横跨一个大的结合表面，这个表面可以包含二级单位和富含半胱氨酸的链接物。令人难以置信的是这些不同的甜味剂结合的事件中，每个事件都会激活一个感觉器官，如果感觉器官没有被激活，就不会察觉到甜味。
在T1R基因里的遗传性变异解释了许多关于通过和穿过物种来检测甜味剂的能力的差异。例如，虽然人们发现阿斯巴甜是甜的，但啮齿动物不认为是甜的。这种物种由于编码T1R2的基因不同导致品尝阿斯巴甜的能力不同。确实，一个合并在人类多样的T1R2VFT领域的混合啮齿动物的甜味受体对阿斯巴甜是敏感的，尽管不是所有的啮齿动物都这样。甚至一个氨基酸的改变可以影响甜味受体组合其配合体的能力。在一些老鼠种群里一个普通变体的建立会明显地减少T1R3和糖的密切关系。遗传的不同也会影响甜味剂的测试结果。就如2T2R苦味受体的某一变体回应糖精的例子，假如要解释这个现象就是说一些人发现糖精尝起来有点甜有点苦。
虽然甜味受体的配位选择性指示了哪种化合物会引起甜味，但这些味觉细胞也决定被引起的味觉质量。一个特殊直观的实验说明人类的T2R16受体存在于两种不同的老鼠味觉细胞种群里，如苦味细胞是可以正常表达T2R，再如甜味细胞可以正常表达T1R2和T1R3；同时T2R16受体能回应混合物苯妥英钠1-β-D-吡喃葡萄糖苷。老鼠没有功能性的T2R16直接同源，并且老鼠对苯妥英钠1-β-D-吡喃葡萄糖苷的感觉和人类是不一样的，因为人类会尝到苦味。正如预测的那样，拟人化的老鼠在苦味细胞里表达T2R16，这导致发现苯妥英钠1-β-D-吡喃葡萄糖苷味道的老鼠感到反感（也就是苦味）。但是，那些T2R16被转基因地表达在甜味细胞里的老鼠发现苯妥英钠1-β-D-吡喃葡萄糖苷相当合胃口。因此，T1R2+T1R3决定了什么是甜的但不是为什么是甜的[3]。
1.1.3 甜味信号转导
最早Margolskee等人提出的甜味信号传导途径有两种[14]，以下分别介绍这种途径：①首先是GPCR-Gs-cAMP途径,蔗糖或其它糖类与甜味受体T1R2和T1R3结合后,激活Gαs,Gαs进一步激活腺苷酸环化酶，并产生大量cAMP；升高的cAMP水平会直接打开环核苷酸（cNMP），然后门控离子通道被打开，导致胞外的阳离子内流；或者cAMP简介激活蛋白激酶A，磷酸化细胞底外侧的钾离子通道，导致通道关闭。这两个效应都会导致味细胞去极化，进而导致电压门控的Ca2+内流和神经递质的释放[14]。②GPCR-Gq/Gβγ-IP3途径：人工甜味剂先结合甜味受体，会导致G蛋白α亚基Gq和Gβγ解体，释放的Gβγ均可以激活磷脂酶Cβ2（PLCβ2），水解磷脂酰甘油产生IP3和二脂酰甘油DAG，IP3与细胞内质网上钙库上受体IP3R3结合，导致钙库打开，钙离子内流，细胞质内的钙离子水平升高。升高的钙离子水平，一方面可直接导致TRPM5通道的打开，然后细胞去极化；另一方面强烈的细胞去极化和升高的钙离子水平，会导致ATP从panneix半通道释放。释放的ATP一方面会直接作用于味觉传入神经；另一方面可作用于Ⅲ型（突触前）细胞，从而导致突触前细胞兴奋释放出5-羟色胺(5-HT)；5-HT通过突触连接将信号传递到与之相连味觉神经，5-HT还可以通过旁分泌形式反馈抑制味觉受体细胞；同时ATP也可作用于自身味觉受体细胞，会导致更多ATP释放。但是味觉神经纤维可进一步将甜味信号传递至大脑的味觉神经中枢[14]。
1.1.4 肠道中甜味的表达
相关研究已经证实甜味受体存在于口腔味觉，同时也在肠道系统中存在。一些研究者用RT-PCR技术等证明甜味受体确实有存在于小肠粘膜细胞上，并且通过研究发现有甜味受体T1R2和T1R3的二聚体表达在CD-1小鼠的小肠粘膜上，而且表达水平近端和末端小肠较低，空肠段较高，在小鼠肠内分泌细胞系STC-1中也存在T1R受体家族的表达，但是在吸收性肠上皮细胞系中均未检测到甜味受体的表达。甜味受体的表达水平不仅在小肠从近端到末端的方向上存在着差异，在小肠腺窝绒毛轴上的表达也有差异，而且都是绒毛处表达较高，腺窝处表达较少[7]。
摘要
目的:以一定浓度的蔗糖溶液（12mM/L 或125mM/L）对小鼠进行急性灌胃，观察其对小鼠十二指肠味觉相关基因表达的影响。方法:将小鼠分为对照组（去离子水灌胃）和实验组（不同浓度的蔗糖溶液灌胃）。利用RT-PCR技术检测各组灌胃后不同时间点十二指肠组织味觉相关基因（Cb1、Ob-rb、T1r3、Trpm5）的表达变化。结果: 与对照组相比，蔗糖溶液灌胃影响十二指肠Ob-rb mRNA的表达，主要表现为表达高峰后移:对照组为1h,而蔗糖灌胃组为6h。 蔗糖灌胃组的Trpm5 mRNA的表达变化与对照组基本一致：先下降后上升，低谷在3h，高峰值在24h；并且在灌胃后的同一时间点组间均没有显著性差异。此外，去离子水或蔗糖溶液灌胃对十二指肠Cb1和T1r3 mRNA的表达在24h内均没有显著影响。结论：蔗糖溶液急性灌胃影响十二指肠 Ob-rb mRNA的表达，可能与肠道甜味敏感性改变、胃肠激素分泌以及摄食调节相关。
*查看完整论文请 +Q: 3 5 1 9 1 6 0 7 2
关键字:ICR小鼠急性蔗糖灌胃十二指肠表达水平Effectsofacutesucrosebygavageontheexpressionofassociatedgeneinmouseduodenaltaste
目 录
1.引言 1
1.1 研究背景 1
1.1.1 甜味感受器 1
1.1.2 甜味受体 1
1.1.3 甜味信号转导 2
1.1.4 肠道中甜味的表达 3
1.1.5 甜味剂选择 4
1.1.6 十二指肠及味觉相关基因简介 4
1.2 研究目的 5
1.3 研究内容 5
1.4 研究意义 6
2.实验材料和方法 7
2.1 实验对象及环境 7
2.1.1 雄性ICR小鼠 7
2.1.2 小鼠饲养环境 7
2.2实验试剂和仪器 7
2.2.1实验试剂: 7
2.2.2 实验仪器： 7
2.3实验设计与方法: 8
2.3.1实验设计路线 8
2.3.2实时定量PCR（RT-PCR） 8
2.3.3数据记录与处理 10
3.结果 11
3.1蔗糖灌胃对十二指肠Cb1 mRNA表达量的影响 11
3.2蔗糖灌胃对十二指肠Ob-rb mRNA的表达水平的影响 12
3.3蔗糖灌胃对十二指肠Trpm5 mRNA的表达水平的影响 13
3.4蔗糖灌胃对十二指肠T1r3 mRNA表达量的影响 14
4.讨 论 15
参考文献 17
附 录 18
致 谢 20
1.引言
1.1 研究背景
1.1.1 甜味感受器
最新研究显示，除了5种基本味觉外，脂肪味也是基本味觉之一，还有二价阳离子产生的金属味等等。但目前来看，甜味仍是最重要的味觉，它能激起强烈的摄食欲望。人类的味觉感受器是味蕾，它主要存在于口腔的舌面、软腭、咽部粘膜等处。味蕾是由味蕾细胞组成的，数量一般是50~100个，这些细胞可分为4类，其分类依据是根据其超微结构，可以分为暗细胞（Ⅰ型）、亮细胞（Ⅱ型）、基细胞及干细胞（Ⅲ型）[6]。暗细胞与亮细胞都是味觉感受细胞，由延伸的传入神经纤维支配，在其基底面存在大量的突触能够感受味觉信息[6]。Ⅲ型细胞含有突触，表达电压门控钙离子通道、突触相关蛋白和神经细胞黏附分子等与神经传递相关的蛋白质，可以将感受到的味觉相关刺激直接传导至神经纤维上，并逐级经脑干向上传递至味觉中枢进行信号处理，最终引起味觉的适应性反应[5]。
1.1.2 甜味受体
糖、甜味蛋白、氨基酸和二肽等都是自然界中能够产生甜味的物质。味觉受体第一家族成员中的T1R2和T1R3都属于甜味受体，它们共同表达于舌的轮廓乳头和叶状乳头的味觉受体细胞中 [17]，并且以聚合物形式发挥作用。T1R3会在舌及腭上皮的某些区域的味觉受体细胞中单独表达，这类细胞可以对高浓度的天然甜味剂产生反应[17]。
引起甜味的所有化合物会结合并约束到T1R2和T1R3受体上，但不是所有的甜味剂都会在受体上的相同的位置结合。甜味受体包含了许多甜味剂和甜味测试抑制剂的结合位点。每一个T1R的副族都由3个主要的领域组成，分别是一个在末端的位于细胞外的VFT领域、一个在羧基端的七个横跨细胞膜的领域和一个富含半胱氨酸的链接物。自然的和人工的糖例如蔗糖、葡萄糖和蔗糖素，它们结合在T1R1和T1R3的VFT领域；但是，二肽甜味剂例如阿斯巴甜和纽甜只结合在T1R2的VFT领域。糖精结合囊位于T1R3的七个横跨细胞膜的领域，并且由于甜味抑制剂而紧密的联系在结合位置上。甜味蛋白例如竹芋蛋白和应乐果甜蛋白横跨一个大的结合表面，这个表面可以包含二级单位和富含半胱氨酸的链接物。令人难以置信的是这些不同的甜味剂结合的事件中，每个事件都会激活一个感觉器官，如果感觉器官没有被激活，就不会察觉到甜味。
在T1R基因里的遗传性变异解释了许多关于通过和穿过物种来检测甜味剂的能力的差异。例如，虽然人们发现阿斯巴甜是甜的，但啮齿动物不认为是甜的。这种物种由于编码T1R2的基因不同导致品尝阿斯巴甜的能力不同。确实，一个合并在人类多样的T1R2VFT领域的混合啮齿动物的甜味受体对阿斯巴甜是敏感的，尽管不是所有的啮齿动物都这样。甚至一个氨基酸的改变可以影响甜味受体组合其配合体的能力。在一些老鼠种群里一个普通变体的建立会明显地减少T1R3和糖的密切关系。遗传的不同也会影响甜味剂的测试结果。就如2T2R苦味受体的某一变体回应糖精的例子，假如要解释这个现象就是说一些人发现糖精尝起来有点甜有点苦。
虽然甜味受体的配位选择性指示了哪种化合物会引起甜味，但这些味觉细胞也决定被引起的味觉质量。一个特殊直观的实验说明人类的T2R16受体存在于两种不同的老鼠味觉细胞种群里，如苦味细胞是可以正常表达T2R，再如甜味细胞可以正常表达T1R2和T1R3；同时T2R16受体能回应混合物苯妥英钠1-β-D-吡喃葡萄糖苷。老鼠没有功能性的T2R16直接同源，并且老鼠对苯妥英钠1-β-D-吡喃葡萄糖苷的感觉和人类是不一样的，因为人类会尝到苦味。正如预测的那样，拟人化的老鼠在苦味细胞里表达T2R16，这导致发现苯妥英钠1-β-D-吡喃葡萄糖苷味道的老鼠感到反感（也就是苦味）。但是，那些T2R16被转基因地表达在甜味细胞里的老鼠发现苯妥英钠1-β-D-吡喃葡萄糖苷相当合胃口。因此，T1R2+T1R3决定了什么是甜的但不是为什么是甜的[3]。
1.1.3 甜味信号转导
最早Margolskee等人提出的甜味信号传导途径有两种[14]，以下分别介绍这种途径：①首先是GPCR-Gs-cAMP途径,蔗糖或其它糖类与甜味受体T1R2和T1R3结合后,激活Gαs,Gαs进一步激活腺苷酸环化酶，并产生大量cAMP；升高的cAMP水平会直接打开环核苷酸（cNMP），然后门控离子通道被打开，导致胞外的阳离子内流；或者cAMP简介激活蛋白激酶A，磷酸化细胞底外侧的钾离子通道，导致通道关闭。这两个效应都会导致味细胞去极化，进而导致电压门控的Ca2+内流和神经递质的释放[14]。②GPCR-Gq/Gβγ-IP3途径：人工甜味剂先结合甜味受体，会导致G蛋白α亚基Gq和Gβγ解体，释放的Gβγ均可以激活磷脂酶Cβ2（PLCβ2），水解磷脂酰甘油产生IP3和二脂酰甘油DAG，IP3与细胞内质网上钙库上受体IP3R3结合，导致钙库打开，钙离子内流，细胞质内的钙离子水平升高。升高的钙离子水平，一方面可直接导致TRPM5通道的打开，然后细胞去极化；另一方面强烈的细胞去极化和升高的钙离子水平，会导致ATP从panneix半通道释放。释放的ATP一方面会直接作用于味觉传入神经；另一方面可作用于Ⅲ型（突触前）细胞，从而导致突触前细胞兴奋释放出5-羟色胺(5-HT)；5-HT通过突触连接将信号传递到与之相连味觉神经，5-HT还可以通过旁分泌形式反馈抑制味觉受体细胞；同时ATP也可作用于自身味觉受体细胞，会导致更多ATP释放。但是味觉神经纤维可进一步将甜味信号传递至大脑的味觉神经中枢[14]。
1.1.4 肠道中甜味的表达
相关研究已经证实甜味受体存在于口腔味觉，同时也在肠道系统中存在。一些研究者用RT-PCR技术等证明甜味受体确实有存在于小肠粘膜细胞上，并且通过研究发现有甜味受体T1R2和T1R3的二聚体表达在CD-1小鼠的小肠粘膜上，而且表达水平近端和末端小肠较低，空肠段较高，在小鼠肠内分泌细胞系STC-1中也存在T1R受体家族的表达，但是在吸收性肠上皮细胞系中均未检测到甜味受体的表达。甜味受体的表达水平不仅在小肠从近端到末端的方向上存在着差异，在小肠腺窝绒毛轴上的表达也有差异，而且都是绒毛处表达较高，腺窝处表达较少[7]。
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