高效液相色谱法测定油脂中苯并（a）芘
高效液相色谱法测定油脂中苯并（a）芘[20200509190254]
摘要：建立了食用油脂苯并(a)芘含量的高效液相色谱法。样品用1.0g弗罗里硅土填充的C18小柱净化，采用高效液相色谱分离，荧光检测器检测。结果表明，苯并(a)芘在0.1 ng/mL~10 ng/mL范围内呈良好线性，相关系数为0.9999。分别对液体油样和固体油样进行加标回收试验，回收率在92%以上，相对标准偏差在1.1%-2.7%之间，方法检出限为0.05 μg/kg。说明该法简单快捷、成本低、灵敏、线性范围宽、精确度高，适用于食用油中苯并(a)芘含量的分析。
关键字：苯并(a)芘；动植物油脂；高效液相色谱；荧光检测器
Determination of fat in benzo (a) pyrene HPLC
Student majoring in food quaity and safety zhangchen
Tutor zhuchengjing lvfengxia
Abstract: A method of determination oils benzo (a) pyrene was established in edible content by HPLC. C18 column was filled with 1.0 gram of sample florisil and sample was detected by fluorescence detector of high performance liquid chromatography. The results showed that a good linear correlation coefficient of 0.9999 of benzo (a) pyrene during 0.1 ng/mL-10 ng/mL. Spiked recoveries of liquid and solid oil samples were over 92%, which the relative standard deviations displayed between 1.1% to 2.7% and the detection limit reached 0.05 μg/kg. It turned out that the method is simple, efficient, low-cost, sensitive, wide linear range and high accuracy and it was suitable for edible oil benzo (a) pyrene content analysis.
引言：多环芳烃化合物（Polycyclic Aromatic Hydrocarbons , PAHs）是广泛存在于环境中的化学污染物，种类很多，美国环境保护署将其中主要的16种化合物列为严加控制的物质，其中部分具有致癌性，如苯并（a）芘、苯并（a）蒽等。苯并(a)芘作为多环芳烃中毒性最大的一种强致癌物，虽不导致急性中毒，但具有强致癌性和致畸性，是世界三大强致癌物之一。因此，受到国内外学者的广泛关注和深入研究。
苯并(a)芘简称Bap，又名3，4-苯并芘，分子式为C20H12，是一种由五个苯环构成的多环芳烃。苯并(a)芘可以由煤炭、石油、天然气、木材等不完全燃烧而产生，也可以在有机物质中产生。纯苯并(a)芘为无色或微黄色针状晶体，易溶于苯，环己烷，二氯甲烷，三氯甲烷，丙酮等有机溶剂。苯并(a)芘是一种强致癌物质，它是有机化合物在高温条件下发生聚合反应产生的，食用油脂本身并不含有或含有很少的苯并(a)芘， 但在种植、加工、运输和烹调过程中， 往往受到污染[1]，其一旦产生就很难分解，因此危害较大。
目前，文献报道有植物油、肉类、大米、茶叶等食品中苯并(a)芘的检测方法[2-5]，测定动植物油脂中苯并(a)芘含量的国标方法有 GB/T5009.27-2003《食物中苯并(a)芘的测定》和 GB/T22509-2008《动植物油脂苯并(a)芘的测定反相高效液相色谱法》。目前分离和测定苯并(a)芘的主要方法有气相色谱法、气相色谱-质谱法、高效液相色谱法、纸色谱荧光光度法、薄层色谱法等。食用油脂中苯并(a)芘的国标方法[6]主要采用是荧光比色法，但该方法样品处理过程较为复杂，同时不能消除本底干扰。
本文采用固相萃取技术处理动植物油样品，避免了通常存在的样品处理麻烦、耗费试剂量大等缺点，减少了有机溶剂的用量，缩短了分析时间，提高了分析效率。旨在建立一种实际用量少、分效果好离、简便快捷的苯并(a)芘的检测方法。
1 实验部分
1.1 仪器与试剂
美国瓦里安Prosfar-230高效液相色谱仪，配有荧光检测器；氮吹仪（MTN-2800W，SCIENCE）；涡旋混合器（XW-80A），海门市其林贝尔仪器制造有限公司)；C18固相萃取小柱（Chrom matrix)。
苯并(a)芘标准品: 10 mg含量99.9%（西格玛公司）；乙腈：色谱纯；实验用水：符合GB /T 6682规定的一级水要求；其它试剂均为分析纯。
样品：植物油，固体油脂匀浆。
1.2 色谱条件
色谱柱：Agilent C18 （4.6×250 mm，5 μm)；
流动相：乙腈/水溶液（80:20，v/v），流速为1.0 mL/min；
荧光检测器：激发波长为384 nm，发射波长为406 nm；
柱温：40℃；进样量：20 μL。
1.3 标准工作曲线绘制
准确称取苯并(a)芘标准1.0 mg到50 mL容量瓶中，用乙腈定容，配制成质量浓度为20 μg/mL的标准贮备液。将标准工作液稀释到浓度分别为：0.1，0.5，1.0，2.0，5.0，10.0 ng/mL，按照最佳色谱分析条件分别进样20 μL，测定相应的峰面积。以苯并(a)芘浓度为横坐标，对应峰面积为纵坐标，根据峰面积建立标准曲线。苯并(a)芘浓度在0.1-10.0 ng/mL范围内线性关系良好，线性回归方程为y=+2.313608e+004x-2.560646e+003。线性回归系数r=0.9995。
1.4 样品处理
1.4.1 液体油样的前处理
用试管称取约0.4 g样品，用6 mL石油醚溶解稀释，旋涡振荡均匀。在C18小柱中填充1.0 g弗罗里硅土，加上筛板。加入5 mL乙腈进行活化，活化程度为液面不覆盖筛板。将溶解好的油样添加到预活化好的C18柱子中，5mL石油醚淋洗样品试管，然后加入C18小柱中至完全滴出并将小柱抽干，弃去石油醚。再加入8 mL乙腈进行洗脱，将洗脱液收集于氮吹管中，直至乙腈完全自然滴出。将洗脱液于水浴中氮气吹干。用乙腈溶解并定容至1.0 mL，经0.45 μm有机滤膜过滤，滤液上机分析。
1.4.2 固体油样的前处理
用玻璃烧杯称取约0.4 g固体油样，加入1.0 g弗罗里硅土，用玻璃棒搅拌混匀后填充到C18小柱中，压实加入筛板。加入8 mL乙腈直接进行洗脱，将洗脱液收集于氮吹管中，直至乙腈完全自然滴出。将洗脱液于水浴中氮气吹干。用乙腈溶解并定容至1.0 mL，经0.45 μm有机滤膜过滤，滤液上机分析。
1.5 弗罗里圭土的选择
弗罗里硅土（硅酸镁载体，绝大部分组分为六硅酸镁）是农药残留量分析净化中最常用的吸附剂。这种吸附剂主要有三种成分：二氧化硅（84%）、氧化镁（15.5%）和硫酸钠（0.5%）。正相条件下能够从非极性基质中强烈吸附极性分析物。被美国环保局指定用于检测环境样品、废水，土壤样品中农药残留。通过使用弗罗里硅土：硅酸镁SPE小柱萃取样品，可以显著降低基质中极性化合物对分析物的干扰。特别用在气象色谱、薄层色谱、纸色谱定性和定量分离和提纯样品，能提供稳定一致的结果。
1.6 定性定量方法
调整仪器为最佳条件，待基线稳定后，取待测液和标准工作液，按多点校准，采用标准物质的保留时间对样品峰进行准确定性，采用外标法以峰面积计算定量。
2 结果与分析
2.1 苯并(a)芘的荧光激发光谱和发射光谱
样品荧光激发光谱反应样品对激发光的吸收特性，能反映样品的一定能及结构，因此样品的荧光激发光谱可用来定性分析。不仅如此，荧光样品还有荧光发射光谱，它也反映样品的结构特性，可用来定性分析，显然增加了判别样品的信息量。苯并(a)芘在紫外和荧光下都有吸收。但荧光检测器只对带荧光基团的物质有响应，因此可有效去除那些不带有荧光基团的杂质对样品测定的干扰，大大提高苯并(a)芘的检测灵敏度，故文章采用荧光检测器检测。对苯并(a)芘标准溶液分别用激发波长350 nm、365 nm、375 nm、384 nm, 发射波长405 nm、406 nm、410 nm进行测定，发现激发波长384 nm和发射波长406 nm时，苯并(a)芘标准溶液的响应值最大；通过不同体积进样量比较，发现进样量20 μL时，峰形较好。
2.2 C18小柱及弗罗里圭土的选择
由于苯并(a)芘的极性很弱，目前常用非极性键合固定相的反相色谱柱来分离。C18柱为表面键合C18烷基的硅胶。这种填料的色谱柱的最大优点是可以使用梯度淋洗，柱效高，分离度好，分离时间短，适于分离多环芳烃这类非极性及极性较弱的低极性化合物。食用油中对苯并(a)芘测定的干扰物质主要有中性脂肪和维生素，因此，需考虑组合不同填料的固相萃取小柱，以尽可能多除去食用油中的干扰物。本方法采用加入弗罗里圭土的C18小柱去除中性脂肪效果好，没有空白背景干扰，承载样品量大，同时萃取效果好，操作方便，在自然重力作用下即可达到极佳的流速范围，重现性好。同时，相比较于苯并(a)芘专用柱成本低，所用试剂量少。
2.3 检出限的确定
苯并(a)芘浓度在0.1~10.0 ng/mL范围内线性关系良好，线性回归方程y=+2.313608e+004x-2.560646e+003。在上述条件下，以仪器S/N=3所相当的标准物浓度作为检出限，计算本方法苯并(a)芘的最小检出限为0.05 μg/kg。
2.4 方法的精密度试验
本实验分别测定了不同食用油中苯并(a)芘的含量，每份样品分别称取6份作为平行样按照本实验建立的方法进行前处理，上机分析，结果如表1所示。测定液体油及固体油的相对标准偏差分别为2.7%和1.1%。结果表明该方法精密度较高，满足分析要求。
表1 精密度试验结果
Table 1 The results of precision test
样品 6次测定含量（μg/kg） 平均值（μg/kg） RSD（%)
液体油 0.087 0.086 0.084 0.088 0.083 0.089 0.086 2.7
固体油 1.043 1.012 1.040 1.030 1.024 1.028 1.030 1.1
2.5 方法的加标回收率
分别以液体固体油液为例，考察方法的加标回收率。对2份油样品进行加标回收试验，按照油样中苯并(a)芘的含量80%、100%、120%三个水平分别添加苯并(a)芘标准溶液，每个水平重复3次，按照上述前处理步骤处理后测定，计算平均加标回收率和相对标准偏差，结果见表2。结果表明各水平的加标回收率均在90.2%-98.2%之间，完全满足分析需求，用本实验方法可准确测定食用油中苯并(a)芘的含量。
表2 加标回收率试验
Table 2 The recovery of standard addition of BaP
样品 加标量（μg） 三次测定回收率（%） 平均回收率（%） RSD（%)
液体油 0.069 90.2 94.6 92.8 95.03 2.5
0.086 94.2 96.2 97.2
0.103 96.8 97.6 95.7
固体油 0.085 91.2 94.2 93.7 95.40 2.3
1.00 94.8 95.4 96.8
1.50 96.5 97.8 98.2
以上方法测得的苯并(a)芘的标准溶液和样品中苯并(a)芘的色谱图如图1、图2及图3所示。由图可见，样品的干扰峰分离效果较好，杂质出峰时间早，对苯并(a)芘的色谱峰无干扰。
图1 苯并(a)芘标准溶液的HPLC色谱图
Fig. 1 HPLC chromatogram of BaP standard
图2 液体油的HPLC色谱图 图3 固体油的HPLC色谱图
Fig.2 HPLC chromatogram of liquid oil Fig.3 HPLC chromatogram of solid oil
3 讨论
3.1 样品预处理和净化方法的选择
测定食品中苯并(a)芘的经典方法是索氏提取，此法试剂用量大，回流时间长，操作繁琐，本方法具有选择性好，灵敏度高，操作简便，节约时间，减轻了样品制备的工作量，并提高了定性及定量的准确性。
与苯并(a)芘共同萃取出来的极性化合物的量很大，如样品提取不经过净化，极性化合物的色谱峰会把苯并(a)芘的峰掩盖掉。传统方法是采用液液萃取和柱色谱、薄层色谱或纸色谱分离杂质进行净化，传统方法不仅安全性差，且操作繁琐，耗时较长。本法采用较为先进的固相萃取前处理技术，固相萃取技术具有背景值低、便捷、安全（有机溶剂用量少）和高效的特点。由于苯并(a)芘的极性很弱，本法采用C18固相萃取小柱，同时加入弗罗里圭土进行样品净化。试样经过萃取小柱时，弱极性苯并(a)芘在柱上保留，大部分极性化合物不保留与苯并(a)芘分离。
3.2 不同方法的选择
前已有建立反相高效液相色谱法测定动植物油脂中苯并(a)芘含量的方法[1]。该方法将适量的试样溶解于石油醚中用中性氧化铝柱净化，用石油醚洗脱苯并(a)芘，荧光检测器检测。该方法的最低检出限为0.1 ng/g 苯并(a)芘的回收率为84.3%以上，相对标准偏差在2.0%-16.7%之间。与本方法相比前处理方法复杂繁琐，回收率偏低，中性氧化铝处理繁琐不易操作。国产中性氧化铝活性差异性大。
济南市场出现的一种检测方法[12]，实验根据无键合硅胶固相萃取柱对不同极性的物质吸附力不同的原理，对样品进行预处理，再用高效液相色谱-荧光检测法进行检测，此方法回收率在85.8%以上，精密度在2.9%-4.5%。该方法实际用量少，简便快速的测定苯并(a)芘含量，但回收率较低，不能达到90%以上，且该法相对标准偏差较高。
改进方法，采用GB/T24893-2010《动植物油脂多环芳烃的测定》中的液液萃取方法提取动植物油脂中的苯并(a)芘，用中性氧化铝固相萃取柱净化，用反相高效液相色谱法-荧光检测器定量检测[8]。改进方法回收率范围在90%-95%，操作简单，试样能净化完全，结果重现性好，定量准确。虽本方法得到的回收率很高，但前处理方法最繁琐，不能用于快速检测。
本文所述方法与以上相比，具有较高的回收率，与改进方法相比只需加入1 g弗罗里硅土填充到C18小柱进行净化，便能达到较高回收率，其操作简便，相对标准偏差较小，有机溶剂使用量减少，缩短操作时间。
前处理方法的优化，本方法采用弗罗里硅土填充到C18小柱的方法，较之直接采用C18色谱柱分离，乙腈和水做流动相，荧光检测[17]。虽后者回收率在91.42%以上，但本法线性范围宽、精确度高，分离效果好，试剂用量少。
4 结论
本文建立了食用油中苯并(a)芘的高效液相色谱-荧光测定方法。采用加弗罗里硅土的C18小柱处理了动植物油样品，去除了样品中的干扰，减少了有机溶剂的用量，缩短了分析时间，提高了分析效率，操作简便，准确率高，灵敏度高。结果完全能满足食品检验的需要，可用于实际样品测定，结果可靠，可在检测工作中推广使用。
致谢
参考文献
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摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1 实验部分2
1.1 仪器与试剂2
1.2 色谱条件2
1.3 标准工作曲线绘制2
1.4 样品处理3
1.4.1 液体油样的前处理3
1.4.2 固体油样的前处理3
1.5弗罗里圭土的选择3
1.6 定性定量方法3
2 结果与分析4
2.1苯并(a)芘的荧光激发光谱和发射光谱4
2.2 C18小柱及弗罗里圭土的选择4
2.3 检出限的确定4
2.4方法的精密度试验4
2.5 方法的加标回收率5
3 讨论6
3.1样品预处理和净化方法的选择6
3.2 不同方法的选择6
4 结论7
致谢7
参考文献7
图1苯并(a)芘标准溶液的HPLC色谱图5
图2 液体油的HPLC色谱图6
图3 固体油的HPLC色谱图6
表1精密度试验结果5
表2加标回收率试验5
高效液相色谱法测定油脂中苯并(a)芘
引言
摘要：建立了食用油脂苯并(a)芘含量的高效液相色谱法。样品用1.0g弗罗里硅土填充的C18小柱净化，采用高效液相色谱分离，荧光检测器检测。结果表明，苯并(a)芘在0.1 ng/mL~10 ng/mL范围内呈良好线性，相关系数为0.9999。分别对液体油样和固体油样进行加标回收试验，回收率在92%以上，相对标准偏差在1.1%-2.7%之间，方法检出限为0.05 μg/kg。说明该法简单快捷、成本低、灵敏、线性范围宽、精确度高，适用于食用油中苯并(a)芘含量的分析。
关键字：苯并(a)芘；动植物油脂；高效液相色谱；荧光检测器
Determination of fat in benzo (a) pyrene HPLC
Student majoring in food quaity and safety zhangchen
Tutor zhuchengjing lvfengxia
Abstract: A method of determination oils benzo (a) pyrene was establish
引言：多环芳烃化合物（Polycyclic Aromatic Hydrocarbons , PAHs）是广泛存在于环境中的化学污染物，种类很多，美国环境保护署将其中主要的16种化合物列为严加控制的物质，其中部分具有致癌性，如苯并（a）芘、苯并（a）蒽等。苯并(a)芘作为多环芳烃中毒性最大的一种强致癌物，虽不导致急性中毒，但具有强致癌性和致畸性，是世界三大强致癌物之一。因此，受到国内外学者的广泛关注和深入研究。
苯并(a)芘简称Bap，又名3，4-苯并芘，分子式为C20H12，是一种由五个苯环构成的多环芳烃。苯并(a)芘可以由煤炭、石油、天然气、木材等不完全燃烧而产生，也可以在有机物质中产生。纯苯并(a)芘为无色或微黄色针状晶体，易溶于苯，环己烷，二氯甲烷，三氯甲烷，丙酮等有机溶剂。苯并(a)芘是一种强致癌物质，它是有机化合物在高温条件下发生聚合反应产生的，食用油脂本身并不含有或含有很少的苯并(a)芘， 但在种植、加工、运输和烹调过程中， 往往受到污染[1]，其一旦产生就很难分解，因此危害较大。
目前，文献报道有植物油、肉类、大米、茶叶等食品中苯并(a)芘的检测方法[2-5]，测定动植物油脂中苯并(a)芘含量的国标方法有 GB/T5009.27-2003《食物中苯并(a)芘的测定》和 GB/T22509-2008《动植物油脂苯并(a)芘的测定反相高效液相色谱法》。目前分离和测定苯并(a)芘的主要方法有气相色谱法、气相色谱-质谱法、高效液相色谱法、纸色谱荧光光度法、薄层色谱法等。食用油脂中苯并(a)芘的国标方法[6]主要采用是荧光比色法，但该方法样品处理过程较为复杂，同时不能消除本底干扰。
本文采用固相萃取技术处理动植物油样品，避免了通常存在的样品处理麻烦、耗费试剂量大等缺点，减少了有机溶剂的用量，缩短了分析时间，提高了分析效率。旨在建立一种实际用量少、分效果好离、简便快捷的苯并(a)芘的检测方法。
1 实验部分
1.1 仪器与试剂
美国瓦里安Prosfar-230高效液相色谱仪，配有荧光检测器；氮吹仪（MTN-2800W，SCIENCE）；涡旋混合器（XW-80A），海门市其林贝尔仪器制造有限公司)；C18固相萃取小柱（Chrom matrix)。
苯并(a)芘标准品: 10 mg含量99.9%（西格玛公司）；乙腈：色谱纯；实验用水：符合GB /T 6682规定的一级水要求；其它试剂均为分析纯。
样品：植物油，固体油脂匀浆。
1.2 色谱条件
色谱柱：Agilent C18 （4.6×250 mm，5 μm)；
流动相：乙腈/水溶液（80:20，v/v），流速为1.0 mL/min；
荧光检测器：激发波长为384 nm，发射波长为406 nm；
柱温：40℃；进样量：20 μL。
1.3 标准工作曲线绘制
准确称取苯并(a)芘标准1.0 mg到50 mL容量瓶中，用乙腈定容，配制成质量浓度为20 μg/mL的标准贮备液。将标准工作液稀释到浓度分别为：0.1，0.5，1.0，2.0，5.0，10.0 ng/mL，按照最佳色谱分析条件分别进样20 μL，测定相应的峰面积。以苯并(a)芘浓度为横坐标，对应峰面积为纵坐标，根据峰面积建立标准曲线。苯并(a)芘浓度在0.1-10.0 ng/mL范围内线性关系良好，线性回归方程为y=+2.313608e+004x-2.560646e+003。线性回归系数r=0.9995。
1.4 样品处理
1.4.1 液体油样的前处理
用试管称取约0.4 g样品，用6 mL石油醚溶解稀释，旋涡振荡均匀。在C18小柱中填充1.0 g弗罗里硅土，加上筛板。加入5 mL乙腈进行活化，活化程度为液面不覆盖筛板。将溶解好的油样添加到预活化好的C18柱子中，5mL石油醚淋洗样品试管，然后加入C18小柱中至完全滴出并将小柱抽干，弃去石油醚。再加入8 mL乙腈进行洗脱，将洗脱液收集于氮吹管中，直至乙腈完全自然滴出。将洗脱液于水浴中氮气吹干。用乙腈溶解并定容至1.0 mL，经0.45 μm有机滤膜过滤，滤液上机分析。
1.4.2 固体油样的前处理
用玻璃烧杯称取约0.4 g固体油样，加入1.0 g弗罗里硅土，用玻璃棒搅拌混匀后填充到C18小柱中，压实加入筛板。加入8 mL乙腈直接进行洗脱，将洗脱液收集于氮吹管中，直至乙腈完全自然滴出。将洗脱液于水浴中氮气吹干。用乙腈溶解并定容至1.0 mL，经0.45 μm有机滤膜过滤，滤液上机分析。
1.5 弗罗里圭土的选择
弗罗里硅土（硅酸镁载体，绝大部分组分为六硅酸镁）是农药残留量分析净化中最常用的吸附剂。这种吸附剂主要有三种成分：二氧化硅（84%）、氧化镁（15.5%）和硫酸钠（0.5%）。正相条件下能够从非极性基质中强烈吸附极性分析物。被美国环保局指定用于检测环境样品、废水，土壤样品中农药残留。通过使用弗罗里硅土：硅酸镁SPE小柱萃取样品，可以显著降低基质中极性化合物对分析物的干扰。特别用在气象色谱、薄层色谱、纸色谱定性和定量分离和提纯样品，能提供稳定一致的结果。
1.6 定性定量方法
调整仪器为最佳条件，待基线稳定后，取待测液和标准工作液，按多点校准，采用标准物质的保留时间对样品峰进行准确定性，采用外标法以峰面积计算定量。
2 结果与分析
2.1 苯并(a)芘的荧光激发光谱和发射光谱
样品荧光激发光谱反应样品对激发光的吸收特性，能反映样品的一定能及结构，因此样品的荧光激发光谱可用来定性分析。不仅如此，荧光样品还有荧光发射光谱，它也反映样品的结构特性，可用来定性分析，显然增加了判别样品的信息量。苯并(a)芘在紫外和荧光下都有吸收。但荧光检测器只对带荧光基团的物质有响应，因此可有效去除那些不带有荧光基团的杂质对样品测定的干扰，大大提高苯并(a)芘的检测灵敏度，故文章采用荧光检测器检测。对苯并(a)芘标准溶液分别用激发波长350 nm、365 nm、375 nm、384 nm, 发射波长405 nm、406 nm、410 nm进行测定，发现激发波长384 nm和发射波长406 nm时，苯并(a)芘标准溶液的响应值最大；通过不同体积进样量比较，发现进样量20 μL时，峰形较好。
2.2 C18小柱及弗罗里圭土的选择
由于苯并(a)芘的极性很弱，目前常用非极性键合固定相的反相色谱柱来分离。C18柱为表面键合C18烷基的硅胶。这种填料的色谱柱的最大优点是可以使用梯度淋洗，柱效高，分离度好，分离时间短，适于分离多环芳烃这类非极性及极性较弱的低极性化合物。食用油中对苯并(a)芘测定的干扰物质主要有中性脂肪和维生素，因此，需考虑组合不同填料的固相萃取小柱，以尽可能多除去食用油中的干扰物。本方法采用加入弗罗里圭土的C18小柱去除中性脂肪效果好，没有空白背景干扰，承载样品量大，同时萃取效果好，操作方便，在自然重力作用下即可达到极佳的流速范围，重现性好。同时，相比较于苯并(a)芘专用柱成本低，所用试剂量少。
2.3 检出限的确定
苯并(a)芘浓度在0.1~10.0 ng/mL范围内线性关系良好，线性回归方程y=+2.313608e+004x-2.560646e+003。在上述条件下，以仪器S/N=3所相当的标准物浓度作为检出限，计算本方法苯并(a)芘的最小检出限为0.05 μg/kg。
2.4 方法的精密度试验
本实验分别测定了不同食用油中苯并(a)芘的含量，每份样品分别称取6份作为平行样按照本实验建立的方法进行前处理，上机分析，结果如表1所示。测定液体油及固体油的相对标准偏差分别为2.7%和1.1%。结果表明该方法精密度较高，满足分析要求。
表1 精密度试验结果
Table 1 The results of precision test
样品 6次测定含量（μg/kg） 平均值（μg/kg） RSD（%)
液体油 0.087 0.086 0.084 0.088 0.083 0.089 0.086 2.7
固体油 1.043 1.012 1.040 1.030 1.024 1.028 1.030 1.1
2.5 方法的加标回收率
分别以液体固体油液为例，考察方法的加标回收率。对2份油样品进行加标回收试验，按照油样中苯并(a)芘的含量80%、100%、120%三个水平分别添加苯并(a)芘标准溶液，每个水平重复3次，按照上述前处理步骤处理后测定，计算平均加标回收率和相对标准偏差，结果见表2。结果表明各水平的加标回收率均在90.2%-98.2%之间，完全满足分析需求，用本实验方法可准确测定食用油中苯并(a)芘的含量。
表2 加标回收率试验
Table 2 The recovery of standard addition of BaP
样品 加标量（μg） 三次测定回收率（%） 平均回收率（%） RSD（%)
液体油 0.069 90.2 94.6 92.8 95.03 2.5
0.086 94.2 96.2 97.2
0.103 96.8 97.6 95.7
固体油 0.085 91.2 94.2 93.7 95.40 2.3
1.00 94.8 95.4 96.8
1.50 96.5 97.8 98.2
以上方法测得的苯并(a)芘的标准溶液和样品中苯并(a)芘的色谱图如图1、图2及图3所示。由图可见，样品的干扰峰分离效果较好，杂质出峰时间早，对苯并(a)芘的色谱峰无干扰。
图1 苯并(a)芘标准溶液的HPLC色谱图
Fig. 1 HPLC chromatogram of BaP standard
图2 液体油的HPLC色谱图 图3 固体油的HPLC色谱图
Fig.2 HPLC chromatogram of liquid oil Fig.3 HPLC chromatogram of solid oil
3 讨论
3.1 样品预处理和净化方法的选择
测定食品中苯并(a)芘的经典方法是索氏提取，此法试剂用量大，回流时间长，操作繁琐，本方法具有选择性好，灵敏度高，操作简便，节约时间，减轻了样品制备的工作量，并提高了定性及定量的准确性。
与苯并(a)芘共同萃取出来的极性化合物的量很大，如样品提取不经过净化，极性化合物的色谱峰会把苯并(a)芘的峰掩盖掉。传统方法是采用液液萃取和柱色谱、薄层色谱或纸色谱分离杂质进行净化，传统方法不仅安全性差，且操作繁琐，耗时较长。本法采用较为先进的固相萃取前处理技术，固相萃取技术具有背景值低、便捷、安全（有机溶剂用量少）和高效的特点。由于苯并(a)芘的极性很弱，本法采用C18固相萃取小柱，同时加入弗罗里圭土进行样品净化。试样经过萃取小柱时，弱极性苯并(a)芘在柱上保留，大部分极性化合物不保留与苯并(a)芘分离。
3.2 不同方法的选择
前已有建立反相高效液相色谱法测定动植物油脂中苯并(a)芘含量的方法[1]。该方法将适量的试样溶解于石油醚中用中性氧化铝柱净化，用石油醚洗脱苯并(a)芘，荧光检测器检测。该方法的最低检出限为0.1 ng/g 苯并(a)芘的回收率为84.3%以上，相对标准偏差在2.0%-16.7%之间。与本方法相比前处理方法复杂繁琐，回收率偏低，中性氧化铝处理繁琐不易操作。国产中性氧化铝活性差异性大。
济南市场出现的一种检测方法[12]，实验根据无键合硅胶固相萃取柱对不同极性的物质吸附力不同的原理，对样品进行预处理，再用高效液相色谱-荧光检测法进行检测，此方法回收率在85.8%以上，精密度在2.9%-4.5%。该方法实际用量少，简便快速的测定苯并(a)芘含量，但回收率较低，不能达到90%以上，且该法相对标准偏差较高。
改进方法，采用GB/T24893-2010《动植物油脂多环芳烃的测定》中的液液萃取方法提取动植物油脂中的苯并(a)芘，用中性氧化铝固相萃取柱净化，用反相高效液相色谱法-荧光检测器定量检测[8]。改进方法回收率范围在90%-95%，操作简单，试样能净化完全，结果重现性好，定量准确。虽本方法得到的回收率很高，但前处理方法最繁琐，不能用于快速检测。
本文所述方法与以上相比，具有较高的回收率，与改进方法相比只需加入1 g弗罗里硅土填充到C18小柱进行净化，便能达到较高回收率，其操作简便，相对标准偏差较小，有机溶剂使用量减少，缩短操作时间。
前处理方法的优化，本方法采用弗罗里硅土填充到C18小柱的方法，较之直接采用C18色谱柱分离，乙腈和水做流动相，荧光检测[17]。虽后者回收率在91.42%以上，但本法线性范围宽、精确度高，分离效果好，试剂用量少。
4 结论
本文建立了食用油中苯并(a)芘的高效液相色谱-荧光测定方法。采用加弗罗里硅土的C18小柱处理了动植物油样品，去除了样品中的干扰，减少了有机溶剂的用量，缩短了分析时间，提高了分析效率，操作简便，准确率高，灵敏度高。结果完全能满足食品检验的需要，可用于实际样品测定，结果可靠，可在检测工作中推广使用。
致谢
参考文献
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摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1 实验部分2
1.1 仪器与试剂2
1.2 色谱条件2
1.3 标准工作曲线绘制2
1.4 样品处理3
1.4.1 液体油样的前处理3
1.4.2 固体油样的前处理3
1.5弗罗里圭土的选择3
1.6 定性定量方法3
2 结果与分析4
2.1苯并(a)芘的荧光激发光谱和发射光谱4
2.2 C18小柱及弗罗里圭土的选择4
2.3 检出限的确定4
2.4方法的精密度试验4
2.5 方法的加标回收率5
3 讨论6
3.1样品预处理和净化方法的选择6
3.2 不同方法的选择6
4 结论7
致谢7
参考文献7
图1苯并(a)芘标准溶液的HPLC色谱图5
图2 液体油的HPLC色谱图6
图3 固体油的HPLC色谱图6
表1精密度试验结果5
表2加标回收率试验5
高效液相色谱法测定油脂中苯并(a)芘
引言
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