泥鳅皮胶原蛋白肽的制备及其抗氧化活性的研究
目 录
1 引言 1
1.1 胶原蛋白的分子结构 1
1.2 胶原蛋白肽的抗氧化活性概述 1
1.3 胶原蛋白肽的制备 2
1.4 本课题研究的目的和意义 3
2 材料与方法 4
2.1 实验原料 4
2.2 实验试剂 4
2.3 实验设备 5
2.4 实验方法 5
3 结果与分析 10
3.1 泥鳅皮胶原蛋白肽提取率的计算 10
3.2 提取胶原蛋白肽的正交实验 10
3.3 确定最优工艺方案 14
3.4 胶原蛋白肽抗氧化活性的测定 14
结 论 19
致 谢 20
参 考 文 献 21
1 引言
在动物结缔组织中，胶原蛋白是一种重要的结构蛋白，并且广泛存在于动物骨骼、肌腱、韧带、肌肉鞘、肌肉膜、软骨和皮肤中 [1]。同时，它广泛分布于动物体内，是动物体内最丰富的蛋白质。胶原蛋白是动物体内总蛋白的重要组成部分，有着增强骨骼弹性等功能。
在动物的各种组织中，胶原蛋白的含量与动物的年龄大小和动物的内部结构密切相关。同时胶原蛋白分为很多种类，常见的类型有Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型、Ⅴ型和Ⅺ型[2]。现如今，胶原蛋白肽的研究在人们的重视下已经越来越深入。胶原蛋白肽对人体有很多功效，可以给皮肤提供必需的养分，对皮肤细胞的生存环境有很大的改善作用，可以促进皮肤组织的新陈代谢，改善表皮和真皮的结构 [3]。目前，从鱼皮中大量提取胶原蛋白肽已经得到广泛应用。
1.1 胶原蛋白的分子结构
胶原蛋白最常见的结构是由2个α1链 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: %3^5`1^9`1^6^0`7^2#
和1个不同的α2链组成的3条α链交互缠绕形成右手螺旋结构，就形成胶原蛋白独特的非常稳定的三螺旋结构[4]。在鱼皮中，胶原蛋白是Ⅰ型胶原，Ⅰ型胶原分子中含有三个α-多肽链，每一个多肽链中含有1000多个氨基酸 [5]。α-多肽链中的每三种形式氨基酸序列组成一个重复的甘氨酸，因为在甘氨酸上有一个最小的侧链基团，以缩短胶原蛋白α链之间的距离，能够占据最小空间 [6]。胶原蛋白肽的分子量一般约为3-10kDa，是胶原蛋白经过蛋白酶水解形成的小分子蛋白质。从结构上讲，胶原蛋白肽就是水解胶原蛋白，打开胶原蛋白的基本三螺旋结构，将长链肽降解为短链肽，由此形成的多肽混合物就是胶原蛋白肽 [7]。
1.2 胶原蛋白肽的抗氧化性概述
1.2.1 自由基、氧化及抗氧化性的概述
胶原蛋白肽的抗氧化性主要包括胶原蛋白肽还原能力、自由基清除能力、抗脂质过氧化能力和金属离子螯合能力等[8]。抗氧化机制与自由基有一定的联系。分析待测物的抗氧化活性通常是由清除自由基的能力决定的。
自由基主要包括超氧阴离子自由基、羟自由基和脂氧自由基等[9]。自由基主要来源是体内的自动氧化和酶促氧化以及呼吸代入等。大量研究表明，自由基与人类的许多疾病有着密切的关系，例如衰老和癌症等。
人的新陈代谢就像氧化作用。抗氧化剂又被称为自由基清除剂，抗氧化剂是能防止或延缓体内氧化，通过去除体内过量自由基对人体损害的物质 [10]。
1.2.2 胶原蛋白肽的研究现状
近年来，人们逐渐从植物体内中提取高蛋白肽，系统地研究了植物体内高蛋白肽的抗氧化特性 [11]。抗氧化剂的主要功能是捕获或消除人体中富余的自由基，使人体内的生理代谢恢复正常。由此可知，抗氧化肽的主要功能是让体内的自由基达到平衡状态[12]。
胶原蛋白肽具有不同的抗氧化性能，因为不同类型的氨基酸和氨基酸的排列方式不同。研究表明，化学分子质量小的蛋白多肽，抗氧化活性较高[13]；疏水性氨基酸和芳香族氨基酸的含量高对胶原蛋白肽抗氧化活性有增强作用 [14]；含硫氨基酸较多的也起到相同作用。
1.3 胶原蛋白肽的制备
胶原蛋白肽的制备分为两步提取和分离纯化，现分述如下：
1.3.1 胶原蛋白肽的提取
提取胶原蛋白肽的方法有很多种，但是水产动物的提取方法通常有下面三种：热水浸提、酸碱法浸提、酶法浸提 [15]。
1.3.1.1 热水浸提法
热水提取法是在一定条件下，用热水从原材料中得到水溶性胶原蛋白（肽） [16]。该法的缺点是有时提取温度较高，使得到的大多数胶原蛋白（肽）在高温下变性为明胶，明胶是不具备原生物体的活性与功能，并且在结构上与胶原蛋白（肽）有较大差异。
1.3.1.2 酸碱法浸提法
酸碱法提取法就是在一定环境条件下，用酸或碱法提取胶原蛋白肽。虽然在碱性条件下提取的快速和彻底，但含有羟基和巯基氨基酸的胶原蛋白（肽）的蛋白质都被破坏，并产生了一个消旋作用（结构变化）[17]。虽然酸法提取能最大化保持胶原蛋白（肽）的三螺旋结构，但在酸性条件下提取时间较长而且胶原蛋白肽得率较低。并且酸碱法提取后的废液排放会影响环境。
1.3.1.3 酶法浸提法 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: %3^5`1^9`1^6^0`7^2#
酶法提取法就是在一定的外界环境条件下利用不同的蛋白酶对胶原进行限制性降解，切割下胶原末端肽 [18]。由于赖氨酸或羟基赖氨酸相互作用的胶原分子的端部与胶原肽之间形成共价键，但三重螺旋结构的主要部分仍然是紧密相连的，溶于低浓度的有机酸或中性溶液中的胶原蛋白肽将被提取，通常情况下使用的酶为酸性蛋白酶、碱性蛋白酶、中性蛋白酶、风味蛋白酶等[19]。虽然酶法提取的胶原蛋白肽溶解率高降低胶原的抗原性，但水解不彻底，会导致切除胶原蛋白酶的非螺旋肽，就可能会导致胶原内部结构的变化 [20]。
1.3.2 胶原蛋白肽的分离纯化
1.3.2.1 电泳
在一定条件的溶液中，由于蛋白质的等电点和分子量的差异，能够在电场中按某一方向移动，就可以区分不同的蛋白质[21]。
1.3.2.2 透析
透析膜是半透膜，蛋白质是大分子物质所以不能透过透析膜，但是小分子物质可以透过透析膜进入透析液。所以可以达到分离纯化蛋白质的目的。
1.3.2.3 层析
a.离子交换层析，就是利用蛋白质特有的两性性质，根据蛋白质所带电荷的差异进行分离纯化的一种方法。
b.凝胶过滤又称分子筛层析[22]。分子筛是指具有立体网状结构的多孔介质，此结构内部充满空隙而且孔径大小不一，所以分子筛可以筛除比分子筛孔径大的蛋白质。
1.3.2.4 超速离心
不仅可用于蛋白质的分离纯化，还可用于蛋白质分子量的测定 。因为不同的蛋白质的密度和形状是不同的，不同的蛋白质可以被分离出来 。
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1 引言 1
1.1 胶原蛋白的分子结构 1
1.2 胶原蛋白肽的抗氧化活性概述 1
1.3 胶原蛋白肽的制备 2
1.4 本课题研究的目的和意义 3
2 材料与方法 4
2.1 实验原料 4
2.2 实验试剂 4
2.3 实验设备 5
2.4 实验方法 5
3 结果与分析 10
3.1 泥鳅皮胶原蛋白肽提取率的计算 10
3.2 提取胶原蛋白肽的正交实验 10
3.3 确定最优工艺方案 14
3.4 胶原蛋白肽抗氧化活性的测定 14
结 论 19
致 谢 20
参 考 文 献 21
1 引言
在动物结缔组织中，胶原蛋白是一种重要的结构蛋白，并且广泛存在于动物骨骼、肌腱、韧带、肌肉鞘、肌肉膜、软骨和皮肤中 [1]。同时，它广泛分布于动物体内，是动物体内最丰富的蛋白质。胶原蛋白是动物体内总蛋白的重要组成部分，有着增强骨骼弹性等功能。
在动物的各种组织中，胶原蛋白的含量与动物的年龄大小和动物的内部结构密切相关。同时胶原蛋白分为很多种类，常见的类型有Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型、Ⅴ型和Ⅺ型[2]。现如今，胶原蛋白肽的研究在人们的重视下已经越来越深入。胶原蛋白肽对人体有很多功效，可以给皮肤提供必需的养分，对皮肤细胞的生存环境有很大的改善作用，可以促进皮肤组织的新陈代谢，改善表皮和真皮的结构 [3]。目前，从鱼皮中大量提取胶原蛋白肽已经得到广泛应用。
1.1 胶原蛋白的分子结构
胶原蛋白最常见的结构是由2个α1链 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: %3^5`1^9`1^6^0`7^2#
和1个不同的α2链组成的3条α链交互缠绕形成右手螺旋结构，就形成胶原蛋白独特的非常稳定的三螺旋结构[4]。在鱼皮中，胶原蛋白是Ⅰ型胶原，Ⅰ型胶原分子中含有三个α-多肽链，每一个多肽链中含有1000多个氨基酸 [5]。α-多肽链中的每三种形式氨基酸序列组成一个重复的甘氨酸，因为在甘氨酸上有一个最小的侧链基团，以缩短胶原蛋白α链之间的距离，能够占据最小空间 [6]。胶原蛋白肽的分子量一般约为3-10kDa，是胶原蛋白经过蛋白酶水解形成的小分子蛋白质。从结构上讲，胶原蛋白肽就是水解胶原蛋白，打开胶原蛋白的基本三螺旋结构，将长链肽降解为短链肽，由此形成的多肽混合物就是胶原蛋白肽 [7]。
1.2 胶原蛋白肽的抗氧化性概述
1.2.1 自由基、氧化及抗氧化性的概述
胶原蛋白肽的抗氧化性主要包括胶原蛋白肽还原能力、自由基清除能力、抗脂质过氧化能力和金属离子螯合能力等[8]。抗氧化机制与自由基有一定的联系。分析待测物的抗氧化活性通常是由清除自由基的能力决定的。
自由基主要包括超氧阴离子自由基、羟自由基和脂氧自由基等[9]。自由基主要来源是体内的自动氧化和酶促氧化以及呼吸代入等。大量研究表明，自由基与人类的许多疾病有着密切的关系，例如衰老和癌症等。
人的新陈代谢就像氧化作用。抗氧化剂又被称为自由基清除剂，抗氧化剂是能防止或延缓体内氧化，通过去除体内过量自由基对人体损害的物质 [10]。
1.2.2 胶原蛋白肽的研究现状
近年来，人们逐渐从植物体内中提取高蛋白肽，系统地研究了植物体内高蛋白肽的抗氧化特性 [11]。抗氧化剂的主要功能是捕获或消除人体中富余的自由基，使人体内的生理代谢恢复正常。由此可知，抗氧化肽的主要功能是让体内的自由基达到平衡状态[12]。
胶原蛋白肽具有不同的抗氧化性能，因为不同类型的氨基酸和氨基酸的排列方式不同。研究表明，化学分子质量小的蛋白多肽，抗氧化活性较高[13]；疏水性氨基酸和芳香族氨基酸的含量高对胶原蛋白肽抗氧化活性有增强作用 [14]；含硫氨基酸较多的也起到相同作用。
1.3 胶原蛋白肽的制备
胶原蛋白肽的制备分为两步提取和分离纯化，现分述如下：
1.3.1 胶原蛋白肽的提取
提取胶原蛋白肽的方法有很多种，但是水产动物的提取方法通常有下面三种：热水浸提、酸碱法浸提、酶法浸提 [15]。
1.3.1.1 热水浸提法
热水提取法是在一定条件下，用热水从原材料中得到水溶性胶原蛋白（肽） [16]。该法的缺点是有时提取温度较高，使得到的大多数胶原蛋白（肽）在高温下变性为明胶，明胶是不具备原生物体的活性与功能，并且在结构上与胶原蛋白（肽）有较大差异。
1.3.1.2 酸碱法浸提法
酸碱法提取法就是在一定环境条件下，用酸或碱法提取胶原蛋白肽。虽然在碱性条件下提取的快速和彻底，但含有羟基和巯基氨基酸的胶原蛋白（肽）的蛋白质都被破坏，并产生了一个消旋作用（结构变化）[17]。虽然酸法提取能最大化保持胶原蛋白（肽）的三螺旋结构，但在酸性条件下提取时间较长而且胶原蛋白肽得率较低。并且酸碱法提取后的废液排放会影响环境。
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酶法提取法就是在一定的外界环境条件下利用不同的蛋白酶对胶原进行限制性降解，切割下胶原末端肽 [18]。由于赖氨酸或羟基赖氨酸相互作用的胶原分子的端部与胶原肽之间形成共价键，但三重螺旋结构的主要部分仍然是紧密相连的，溶于低浓度的有机酸或中性溶液中的胶原蛋白肽将被提取，通常情况下使用的酶为酸性蛋白酶、碱性蛋白酶、中性蛋白酶、风味蛋白酶等[19]。虽然酶法提取的胶原蛋白肽溶解率高降低胶原的抗原性，但水解不彻底，会导致切除胶原蛋白酶的非螺旋肽，就可能会导致胶原内部结构的变化 [20]。
1.3.2 胶原蛋白肽的分离纯化
1.3.2.1 电泳
在一定条件的溶液中，由于蛋白质的等电点和分子量的差异，能够在电场中按某一方向移动，就可以区分不同的蛋白质[21]。
1.3.2.2 透析
透析膜是半透膜，蛋白质是大分子物质所以不能透过透析膜，但是小分子物质可以透过透析膜进入透析液。所以可以达到分离纯化蛋白质的目的。
1.3.2.3 层析
a.离子交换层析，就是利用蛋白质特有的两性性质，根据蛋白质所带电荷的差异进行分离纯化的一种方法。
b.凝胶过滤又称分子筛层析[22]。分子筛是指具有立体网状结构的多孔介质，此结构内部充满空隙而且孔径大小不一，所以分子筛可以筛除比分子筛孔径大的蛋白质。
1.3.2.4 超速离心
不仅可用于蛋白质的分离纯化，还可用于蛋白质分子量的测定 。因为不同的蛋白质的密度和形状是不同的，不同的蛋白质可以被分离出来 。
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