云南土壤宏基因组文库中四环素耐药基因的筛选
摘要：近年来，耐药基因作为致病源而导致的危及动物和人类生命安全的事件越来越多，土壤中耐药基因的发现为这项研究带来新的方向。本实验采用宏基因组学方法，用采集到的云南土壤菌作原始文库菌，从而对其进行筛查。筛选步骤主要是通过在含有抗生素的液体或固体培养基中恒温培养，观察其能否生长，并进一步通过提取质粒与载体连接导入大肠杆菌培养等实验步骤进行进一步认证。通过本实验筛选，有部分文库菌呈耐药状态，最终也得到了部分亚克隆。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言2
1实验设备与材料3
1.1实验设备 3
1.2实验材料3
2.实验方法4
2.1材料准备4
2.2文库二代菌的保藏4
2.3 24孔板筛选 4
2.4平板筛选5
2.5亚克隆的构建6
2.6测序及序列分析10
实验结果及讨论10
参考文献13
致谢15
云南土壤宏基因组文库中四环素耐药基因的筛选
引言
引言
抗生素是20世纪最重要的医学发现之一。自四十年代被广泛使用以来，抗生素对控制人类及动物感染性疾病发挥了巨大的作用。然而近年来，抗生素的滥用已经导致大量具有耐药基因的细菌的产生，细菌耐药性的大范围爆发如今已成为一个严峻的全球性问题[1]。与此同时，耐药菌及耐药基因在各种环境介质包括食物链中迅速扩散，已成为食品安全与公共健康的重要威胁。世界卫生组织（WHO）已将抗生素耐药基因列入21世纪威胁人类健康的最重大挑战之一，并宣布将在全球范围内对控制耐药基因进行战略部署。然而，各种“超级细菌”以及新型耐药机制的不断涌现暴露了我们对细菌耐药性进化与传播进程认识的不足。耐药基因的产生可能是因为细菌染色体耐药基因的突变、耐药质粒的转移和转座子的插入，使细菌产生一些新的酶类或多肽类物质，破坏抗菌药物或阻挡药物向靶细胞穿透，或发生新的代谢途径，从而产生对抗生素的耐药性，造成临床药物治疗的失败[2]。
研究证明大部分临床病原菌携带的耐药基因其实均起源于自然环境，环境中所有这些具
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^3^5`1^9`1^6^0`7^2#
有直接或间接耐药作用的基因被称为环境耐药基因组。土壤中具有极复杂的微生物多样性，使得庞大的土壤耐药基因组成为最大的耐药基因储藏库[3]。同时，由于抗生素在人医临床以及农业中的广泛使用，大量的抗生素及耐药菌通过各种途径被释放到自然环境中，给环境菌造成新的选择压力，促进环境菌中耐药基因的富集和迁移，从而增加环境菌与致病菌之间发生耐药基因转移的风险。
然而，目前对于环境耐药基因组的研究才刚刚开始。土壤微生物蕴藏着大量未开发的资源，经粗略估算，1克土壤中可包含约580种不同的放线菌，所包含的遗传物质容量可生产11600种生物活性小分子 [3]。然而传统培养方法只能从环境中获得不到1%的微生物，99%的微生物为非培养性微生物。这极大的限制了人类对土壤微生物遗传资源的有效利用于是宏基因组学应运而生，打破了传统方法的瓶颈。宏基因组 ( Metagenome)，由Handelsman 等在1998 年提出，其定义为自然环境中全部微小生物遗传物质的总和[4]。这个概念不仅包含可培养的微生物基因，还包括未可培养的微生物基因，目前主要包括环境样品中细菌和真菌的基因组总和。宏基因组学让我们的研究对象从单个微生物基因组扩大到整个群体中所有个体的基因组。土壤微生物组成复杂、类群繁多、数量巨大，造成宏基因组文库容量庞大，因此，从数量巨大的文库克隆子中筛选目的基因需要高效的筛选方法。目前，宏基因组文库的高通量筛选方法主要有同源序列筛选和功能筛选两种策略[4]：（1）功能筛选主要利用基因在宿主中的表达所表现出的特性，通过化学或生物化学的手段从克隆文库中筛选表达目标活性物质的阳性克隆；（2）同源序列筛选是指根据已知的基因或基因表达产物的保守序列设计PCR引物或探针，通过PCR扩增或杂交筛选文库中的阳性克隆子，以获得某一类结构或功能类似的蛋白质中的新分子或其编码基因。
细菌抗生素耐药性在全世界范围内的爆发暴露了我们对细菌耐药性进化与传播进程认识的不足。耐药菌及耐药基因的扩散已严重威胁生态环境及人类健康。我们一方面需要开发更多有效的抗菌药物，另一方面需要更深入地理解抗生素耐药性的发生与发展过程。今后的研究重点将不再局限于临床菌株耐药性及动物源性食品抗生素残留的监控，而在于从生态学的角度更深入的理解耐药基因的生态学功能，包括其来源、分布、作用机理、迁移扩散机制，以及对生态环境和人类健康构成的威胁。新的宏基因组学方法以及分子生物学和遗传学技术（如高通量测序技术）的发展为最大限度挖掘土壤中庞大的未开发的耐药基因组资源提供了可能。我国拥有丰富的土壤环境和特色土壤生态系统的微生物类群，蕴含着特殊生理、生态效应的新物种和相应的天然产物资源，然而我国宏基因组学相关研究起步较晚，利用宏基因组学方法发掘耐药基因组的研究尚属空白。在本研究中，我们将临床上常用的四环素作为研究对象，利用实验室已构建的云南栗树林土壤宏基因组文库，使用表型筛选的方法从中筛选新型四环素耐药基因。
实验设备与材料
1.1实验设备
本实验所用到的器材主要为电子设备，电子设备均由实验室供应。
1）超净台，苏洁净化；
2）DYY6C型电泳仪，北京市六一仪器厂；
3）KQ5200V型超声波清洗器；
4）金属浴；
5）Sartorius114微量台式离心机，SIGMAR；
6）梯度基因扩增仪；
7）4℃冰箱，中科美菱；
Wise Cryo（R）WUFD86℃数显超低温冰箱，南京新飞达光电科学技术有限公司；
中科美菱DWYL270型25℃超低温冰箱;
精密电子天平,上海民侨精密科学仪器有限公司;
恒温培养摇床;
电热恒温鼓风干燥箱，上海精宏实验设备有限公司;
微波炉，美的;
立式压力蒸汽灭菌器,南京驰远生物科技有限公司;
移液器,百得移液器服务中心;
紫外琼脂糖凝胶成像仪，南京博惠科学仪器有限公司；
HitechSciencetool系列超纯水系统
IMS40型雪科全自动雪花制冰机，苏州安创仪器有限公司；
电热恒温培养箱，上海精宏实验设备有限公司；
1.2实验材料
1）酵母粉， Sangon Biotech;
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言2
1实验设备与材料3
1.1实验设备 3
1.2实验材料3
2.实验方法4
2.1材料准备4
2.2文库二代菌的保藏4
2.3 24孔板筛选 4
2.4平板筛选5
2.5亚克隆的构建6
2.6测序及序列分析10
实验结果及讨论10
参考文献13
致谢15
云南土壤宏基因组文库中四环素耐药基因的筛选
引言
引言
抗生素是20世纪最重要的医学发现之一。自四十年代被广泛使用以来，抗生素对控制人类及动物感染性疾病发挥了巨大的作用。然而近年来，抗生素的滥用已经导致大量具有耐药基因的细菌的产生，细菌耐药性的大范围爆发如今已成为一个严峻的全球性问题[1]。与此同时，耐药菌及耐药基因在各种环境介质包括食物链中迅速扩散，已成为食品安全与公共健康的重要威胁。世界卫生组织（WHO）已将抗生素耐药基因列入21世纪威胁人类健康的最重大挑战之一，并宣布将在全球范围内对控制耐药基因进行战略部署。然而，各种“超级细菌”以及新型耐药机制的不断涌现暴露了我们对细菌耐药性进化与传播进程认识的不足。耐药基因的产生可能是因为细菌染色体耐药基因的突变、耐药质粒的转移和转座子的插入，使细菌产生一些新的酶类或多肽类物质，破坏抗菌药物或阻挡药物向靶细胞穿透，或发生新的代谢途径，从而产生对抗生素的耐药性，造成临床药物治疗的失败[2]。
研究证明大部分临床病原菌携带的耐药基因其实均起源于自然环境，环境中所有这些具
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^3^5`1^9`1^6^0`7^2#
有直接或间接耐药作用的基因被称为环境耐药基因组。土壤中具有极复杂的微生物多样性，使得庞大的土壤耐药基因组成为最大的耐药基因储藏库[3]。同时，由于抗生素在人医临床以及农业中的广泛使用，大量的抗生素及耐药菌通过各种途径被释放到自然环境中，给环境菌造成新的选择压力，促进环境菌中耐药基因的富集和迁移，从而增加环境菌与致病菌之间发生耐药基因转移的风险。
然而，目前对于环境耐药基因组的研究才刚刚开始。土壤微生物蕴藏着大量未开发的资源，经粗略估算，1克土壤中可包含约580种不同的放线菌，所包含的遗传物质容量可生产11600种生物活性小分子 [3]。然而传统培养方法只能从环境中获得不到1%的微生物，99%的微生物为非培养性微生物。这极大的限制了人类对土壤微生物遗传资源的有效利用于是宏基因组学应运而生，打破了传统方法的瓶颈。宏基因组 ( Metagenome)，由Handelsman 等在1998 年提出，其定义为自然环境中全部微小生物遗传物质的总和[4]。这个概念不仅包含可培养的微生物基因，还包括未可培养的微生物基因，目前主要包括环境样品中细菌和真菌的基因组总和。宏基因组学让我们的研究对象从单个微生物基因组扩大到整个群体中所有个体的基因组。土壤微生物组成复杂、类群繁多、数量巨大，造成宏基因组文库容量庞大，因此，从数量巨大的文库克隆子中筛选目的基因需要高效的筛选方法。目前，宏基因组文库的高通量筛选方法主要有同源序列筛选和功能筛选两种策略[4]：（1）功能筛选主要利用基因在宿主中的表达所表现出的特性，通过化学或生物化学的手段从克隆文库中筛选表达目标活性物质的阳性克隆；（2）同源序列筛选是指根据已知的基因或基因表达产物的保守序列设计PCR引物或探针，通过PCR扩增或杂交筛选文库中的阳性克隆子，以获得某一类结构或功能类似的蛋白质中的新分子或其编码基因。
细菌抗生素耐药性在全世界范围内的爆发暴露了我们对细菌耐药性进化与传播进程认识的不足。耐药菌及耐药基因的扩散已严重威胁生态环境及人类健康。我们一方面需要开发更多有效的抗菌药物，另一方面需要更深入地理解抗生素耐药性的发生与发展过程。今后的研究重点将不再局限于临床菌株耐药性及动物源性食品抗生素残留的监控，而在于从生态学的角度更深入的理解耐药基因的生态学功能，包括其来源、分布、作用机理、迁移扩散机制，以及对生态环境和人类健康构成的威胁。新的宏基因组学方法以及分子生物学和遗传学技术（如高通量测序技术）的发展为最大限度挖掘土壤中庞大的未开发的耐药基因组资源提供了可能。我国拥有丰富的土壤环境和特色土壤生态系统的微生物类群，蕴含着特殊生理、生态效应的新物种和相应的天然产物资源，然而我国宏基因组学相关研究起步较晚，利用宏基因组学方法发掘耐药基因组的研究尚属空白。在本研究中，我们将临床上常用的四环素作为研究对象，利用实验室已构建的云南栗树林土壤宏基因组文库，使用表型筛选的方法从中筛选新型四环素耐药基因。
实验设备与材料
1.1实验设备
本实验所用到的器材主要为电子设备，电子设备均由实验室供应。
1）超净台，苏洁净化；
2）DYY6C型电泳仪，北京市六一仪器厂；
3）KQ5200V型超声波清洗器；
4）金属浴；
5）Sartorius114微量台式离心机，SIGMAR；
6）梯度基因扩增仪；
7）4℃冰箱，中科美菱；
Wise Cryo（R）WUFD86℃数显超低温冰箱，南京新飞达光电科学技术有限公司；
中科美菱DWYL270型25℃超低温冰箱;
精密电子天平,上海民侨精密科学仪器有限公司;
恒温培养摇床;
电热恒温鼓风干燥箱，上海精宏实验设备有限公司;
微波炉，美的;
立式压力蒸汽灭菌器,南京驰远生物科技有限公司;
移液器,百得移液器服务中心;
紫外琼脂糖凝胶成像仪，南京博惠科学仪器有限公司；
HitechSciencetool系列超纯水系统
IMS40型雪科全自动雪花制冰机，苏州安创仪器有限公司；
电热恒温培养箱，上海精宏实验设备有限公司；
1.2实验材料
1）酵母粉， Sangon Biotech;
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