葡萄多酚的体外抗氧化活性研究
摘要：本实验以没食子酸（Gallic acid）为对照品，采用Folin-Ciocalteus法对脱脂葡萄籽多酚粗提物中总酚含量进行测定，结果显示其总酚含量为26.71%。以Vc为对照品，通过清除曲线和IC50值考察了葡萄多酚对超氧阴离子和DPPH自由基的清除能力，其清除超氧阴离子自由基的IC50为4.73mg/ml，清除DPPH自由基的IC50值为4.8μg/ml，结果显示脱脂葡萄籽多酚粗提物清除超氧自由基的效果较差远远小于Vc，清除DPPH自由基的能力略低于Vc。通过还原潜力和铁离子还原力（FRAP）测定来反映葡萄多酚的还原能力，测定结果为在考察范围内其还原潜力最大为1.17，FRAP值为8.18μmol/mg，表示其还原能力较Vc更强。金属离子螯合能力测定结果显示葡萄多酚在实验浓度范围内其铁离子最大螯合率为81.08%。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1材料与方法2
1.1实验材料 2
1.2方法 2
1.2.1 样品中总酚含量的测定2
1.2.2 清除超氧阴离子自由基活性测定3
1.2.3 清除DPPH?自由基活性测定4
1.2.4 金属离子螯合能力测定4
1.2.5 还原潜力测定5
1.2.6 铁离子还原力（FRAP）测定6
2结果与分析6
2.1 脱脂葡萄籽多酚粗提物中总酚含量测定结果6
2.2 清除超氧阴离子自由基活性测定结果7
2.3 清除DPPH?自由基活性测定结果8
2.4 金属离子螯合能力测定结果9
2.5 还原潜力测定结果10
2.6 铁离子还原力（FRAP）测定结果10
3讨论10
致谢11
参考文献11
葡萄多酚的体外抗氧化活性研究
引言
近年来，随着对葡萄籽中化学物质及其生物活性的不断研究，发现葡萄籽有很高的应用和研究价值，对葡萄籽功能成分的提取开发越来越得到重视，例如从中提取葡萄籽油、原花青素和蛋白
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: *351916072*
质等。其中葡萄多酚具有较强的抗氧化性而广受关注，并且葡萄籽中葡萄多酚的种类和含量远远大于葡萄果肉和果皮中的含量[1]。葡萄多酚是葡萄中存在的所有多酚物质的总称，葡萄果肉中主要的多酚类为黄酮型多酚类，包括儿茶素、黄酮、黄酮醇、黄烷醇、黄酮单宁、查耳酮以及花色苷等[2]。葡萄果皮中的多酚主要为花色素类、黄酮以及白黎芦醇等。葡萄籽中主要为儿茶素类、原花青素、懈皮苷、单宁等。而果汁中除了花色素外几乎不含其他的黄酮类，主要为一些非黄酮类型的酚酸类物质[3]。
多酚化合物作为合成抗氧剂(如B H T , B H A 等)的代用品，具有高效、低毒、价廉、易得等优点日益受到重视。国内外研究表明，在众多的植物多酚中，以葡多酚抗氧化、清除自由基的活性最强，其机理是其自身作为优良的供氢体，可通过共振杂化成稳定的自由基，从而使其失活，切断链式反应起到抗氧化作用[4]。而我国每年会产生大量的葡萄废弃物——葡萄皮和葡萄籽。葡萄多酚作为一种天然安全的活性物质，其较好的抗氧化性，在人类营养保健和疾病预防等方面将发挥着十分重要的作用。因此，葡萄多酚的高效提取技术的开发及其抗氧化活性的研究是当今热点[5]。如何充分、合理、科学地利用这一绿色资源，已经成为一项值得不断深人探讨的课题。
本课题主要测定脱脂葡萄籽多酚粗提物中有效抗氧化成分即总酚的含量，运用五种化学方法分别测定分析葡萄籽多酚的体外抗氧化活性，研究其是否具有一定的体外抗氧化活性。
1 材料与方法
1．1 实验材料
1．1．1 原料与试剂
脱脂葡萄籽多酚粗提取物（2014年12月24日生产，实验室自制）；
FC试剂（福林酚试剂）、2，2二苯代苦味肼基自由基（DPPH）、菲洛嗪（ferrozine）；三吡啶吖嗪（TPTZ）、抗坏血酸、甲醇、无水乙醇、没食子酸、碳酸钠、三羟甲基氨基甲烷（Tris）、盐酸、邻苯三酚（焦性没食子酸）、氯化亚铁、氯化铁、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、铁氰化钾、三氯乙酸、乙酸。乙酸钠、硫酸亚铁等都为分析纯试剂。
主要仪器设备
AL104电子天平 (梅特勒托利多仪器有限公司);
MP51001电子天平 (上海恒平科学仪器有限公司)
752S紫外可见分光光度计 (上海棱光技术有限公司)
PHS2C型数显pH计 (上海智光仪器仪表公司)
数控超声波清洗仪 （KQ5200DE型，昆山市超声仪器有限公司）
数显恒温水浴锅 （HHS4型，金坛市医疗仪器厂）
1．2 实验方法
1.2.1 样品中总酚含量的测定
本实验利用FolinCiocalteus比色法，以没食子酸为标准物质测定脱脂葡萄籽提取物中的总多酚含量。参照高婷[4]报道的方法稍作修改。
1.2.1.1 标准品溶液的配制
准确称取50mg没食子酸，用去离子水溶解，定容至100ml配置成浓度为0.5mg/ml的没食子酸母液，然后准确量取1、2、3、4、5ml母液分别于25ml容量瓶中，溶解定容后配制成0.02、0.04、0.06、0.08、0.10mg/ml系列浓度的没食子酸标准品溶液，避光低温保存，备用。
1.2.1.2 待测样品溶液配制
准确称取三份脱脂葡萄籽多酚提取物，加 6ml甲醇超声溶解，分别配制成浓度为0.25mg/ml的样品溶液，避光低温保存，备用。
FolinCiocalteus 比色测定原理
FolinCiocalteus法的测定原理[6]是基于碱性条件下FC试剂中的钨钼酸被多酚化合物定量还原,自身从W6+还原为W5+蓝色化合物且该蓝色化合物在747nm有最大吸收,且蓝色深浅与多酚含量呈正相关,因此可以通过该比色方法来对多酚进行定量检测。
测定方法
分别精密量取0.02、0.04、0.06、0.08、0.10mg/ml没食子酸溶液100μl于试管中，分别加入稀释十倍的FC试剂1.0ml，混匀反应体系，于暗处30℃水浴5min,取出试管并加入10%Na2CO3 2.0ml，混匀反应体系，暗处30℃水浴1h后于分光光度计747nm处测定吸光值。以吸光值为纵坐标，没食子酸溶液浓度为横坐标绘制为标准工作曲线。以水代替没食子酸溶液，作参比实验调零用。
从三份待测样品溶液中精确量取100μl，按照上述步骤测定反应后样品溶液于747nm的吸光值。根据标准工作曲线计算样品中总酚含量。
1.2.2 清除超氧阴离子自由基活性测定
1.2.2.1 对照品Vc溶液的配制
准确称取0.1000g抗坏血酸，用去离子水溶解后转移至100ml容量瓶定容至刻度线，配置成为1mg/ml的Vc母液，然后精密量取1.25、2.50、、3.75、5.00、6.25ml分别于50ml容量瓶中，加去离子水定容后得到浓度分别为0.025、0.050、0.075、0.100、0.125mg/ml的Vc溶液，低温避光保存，备用。
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摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1材料与方法2
1.1实验材料 2
1.2方法 2
1.2.1 样品中总酚含量的测定2
1.2.2 清除超氧阴离子自由基活性测定3
1.2.3 清除DPPH?自由基活性测定4
1.2.4 金属离子螯合能力测定4
1.2.5 还原潜力测定5
1.2.6 铁离子还原力（FRAP）测定6
2结果与分析6
2.1 脱脂葡萄籽多酚粗提物中总酚含量测定结果6
2.2 清除超氧阴离子自由基活性测定结果7
2.3 清除DPPH?自由基活性测定结果8
2.4 金属离子螯合能力测定结果9
2.5 还原潜力测定结果10
2.6 铁离子还原力（FRAP）测定结果10
3讨论10
致谢11
参考文献11
葡萄多酚的体外抗氧化活性研究
引言
近年来，随着对葡萄籽中化学物质及其生物活性的不断研究，发现葡萄籽有很高的应用和研究价值，对葡萄籽功能成分的提取开发越来越得到重视，例如从中提取葡萄籽油、原花青素和蛋白
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: *351916072*
质等。其中葡萄多酚具有较强的抗氧化性而广受关注，并且葡萄籽中葡萄多酚的种类和含量远远大于葡萄果肉和果皮中的含量[1]。葡萄多酚是葡萄中存在的所有多酚物质的总称，葡萄果肉中主要的多酚类为黄酮型多酚类，包括儿茶素、黄酮、黄酮醇、黄烷醇、黄酮单宁、查耳酮以及花色苷等[2]。葡萄果皮中的多酚主要为花色素类、黄酮以及白黎芦醇等。葡萄籽中主要为儿茶素类、原花青素、懈皮苷、单宁等。而果汁中除了花色素外几乎不含其他的黄酮类，主要为一些非黄酮类型的酚酸类物质[3]。
多酚化合物作为合成抗氧剂(如B H T , B H A 等)的代用品，具有高效、低毒、价廉、易得等优点日益受到重视。国内外研究表明，在众多的植物多酚中，以葡多酚抗氧化、清除自由基的活性最强，其机理是其自身作为优良的供氢体，可通过共振杂化成稳定的自由基，从而使其失活，切断链式反应起到抗氧化作用[4]。而我国每年会产生大量的葡萄废弃物——葡萄皮和葡萄籽。葡萄多酚作为一种天然安全的活性物质，其较好的抗氧化性，在人类营养保健和疾病预防等方面将发挥着十分重要的作用。因此，葡萄多酚的高效提取技术的开发及其抗氧化活性的研究是当今热点[5]。如何充分、合理、科学地利用这一绿色资源，已经成为一项值得不断深人探讨的课题。
本课题主要测定脱脂葡萄籽多酚粗提物中有效抗氧化成分即总酚的含量，运用五种化学方法分别测定分析葡萄籽多酚的体外抗氧化活性，研究其是否具有一定的体外抗氧化活性。
1 材料与方法
1．1 实验材料
1．1．1 原料与试剂
脱脂葡萄籽多酚粗提取物（2014年12月24日生产，实验室自制）；
FC试剂（福林酚试剂）、2，2二苯代苦味肼基自由基（DPPH）、菲洛嗪（ferrozine）；三吡啶吖嗪（TPTZ）、抗坏血酸、甲醇、无水乙醇、没食子酸、碳酸钠、三羟甲基氨基甲烷（Tris）、盐酸、邻苯三酚（焦性没食子酸）、氯化亚铁、氯化铁、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、铁氰化钾、三氯乙酸、乙酸。乙酸钠、硫酸亚铁等都为分析纯试剂。
主要仪器设备
AL104电子天平 (梅特勒托利多仪器有限公司);
MP51001电子天平 (上海恒平科学仪器有限公司)
752S紫外可见分光光度计 (上海棱光技术有限公司)
PHS2C型数显pH计 (上海智光仪器仪表公司)
数控超声波清洗仪 （KQ5200DE型，昆山市超声仪器有限公司）
数显恒温水浴锅 （HHS4型，金坛市医疗仪器厂）
1．2 实验方法
1.2.1 样品中总酚含量的测定
本实验利用FolinCiocalteus比色法，以没食子酸为标准物质测定脱脂葡萄籽提取物中的总多酚含量。参照高婷[4]报道的方法稍作修改。
1.2.1.1 标准品溶液的配制
准确称取50mg没食子酸，用去离子水溶解，定容至100ml配置成浓度为0.5mg/ml的没食子酸母液，然后准确量取1、2、3、4、5ml母液分别于25ml容量瓶中，溶解定容后配制成0.02、0.04、0.06、0.08、0.10mg/ml系列浓度的没食子酸标准品溶液，避光低温保存，备用。
1.2.1.2 待测样品溶液配制
准确称取三份脱脂葡萄籽多酚提取物，加 6ml甲醇超声溶解，分别配制成浓度为0.25mg/ml的样品溶液，避光低温保存，备用。
FolinCiocalteus 比色测定原理
FolinCiocalteus法的测定原理[6]是基于碱性条件下FC试剂中的钨钼酸被多酚化合物定量还原,自身从W6+还原为W5+蓝色化合物且该蓝色化合物在747nm有最大吸收,且蓝色深浅与多酚含量呈正相关,因此可以通过该比色方法来对多酚进行定量检测。
测定方法
分别精密量取0.02、0.04、0.06、0.08、0.10mg/ml没食子酸溶液100μl于试管中，分别加入稀释十倍的FC试剂1.0ml，混匀反应体系，于暗处30℃水浴5min,取出试管并加入10%Na2CO3 2.0ml，混匀反应体系，暗处30℃水浴1h后于分光光度计747nm处测定吸光值。以吸光值为纵坐标，没食子酸溶液浓度为横坐标绘制为标准工作曲线。以水代替没食子酸溶液，作参比实验调零用。
从三份待测样品溶液中精确量取100μl，按照上述步骤测定反应后样品溶液于747nm的吸光值。根据标准工作曲线计算样品中总酚含量。
1.2.2 清除超氧阴离子自由基活性测定
1.2.2.1 对照品Vc溶液的配制
准确称取0.1000g抗坏血酸，用去离子水溶解后转移至100ml容量瓶定容至刻度线，配置成为1mg/ml的Vc母液，然后精密量取1.25、2.50、、3.75、5.00、6.25ml分别于50ml容量瓶中，加去离子水定容后得到浓度分别为0.025、0.050、0.075、0.100、0.125mg/ml的Vc溶液，低温避光保存，备用。
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