鲜切茭白线粒体蛋白双向电泳体系建立
摘 要：为建立鲜切茭白线粒体蛋白双向电泳技术体系，研究了不同的线粒体蛋白提取方法、不同的线粒体蛋白纯化方法、不同的蛋白上样量、以及不同pH范围IPG胶条等条件对2-DE的影响。实验结果表明，经过密度梯度离心后并采用酚抽提法制备线粒体蛋白质的方法更好；双向电泳时，采用17 cm 、pH4-7的IPG胶条，采用1.0 mg的线粒体蛋白上样量，同时使用12％的SDS-PAGE的凝胶浓度，最后经过考马斯亮蓝G-250胶体染色法染色后可以获得点迹清晰、数量较多、分辨率高的线粒体蛋白质2-DE图谱。
目录
摘 要 1
关键词 1
Abstract 1
Key words 1
1 材料与方法 2
1.1 材料 2
1.1.1 实验材料 2
1.1.2 试剂 2
1.1.3 仪器： 2
1.2 线粒体蛋白质提取 2
1.2.1 差速离心 2
1.2.2 密度梯度离心 2
1.3 线粒体蛋白的纯化浓缩 3
1.3.1改良酚抽提法 3
1.3.2修改的酚抽法 3
1.4 线粒体蛋白的含量测定 3
1.5双向电泳 3
1.6凝胶的图像采集与分析 3
2 结果与分析 4
2.1不同的提取方法对2DE图的影响 4
2.2 不同纯化方法对蛋白产量的影响 4
2.3 第一向等电聚焦pH范围对2DE效果的影响 4
2.4不同线粒体蛋白上样量对2DE效果的影响 5
3 讨论 6
3.1 线粒体蛋白提取方法 6
3.2 蛋白上样量的选择 6
3.3 IPG胶条pH范围的选择 6
4 结论 6
致谢 7
参考文献： 7
鲜切茭白线粒体蛋白双向电泳体系建立
引言
线粒体是真核生物非常重要的亚细胞器，在生命过程中发挥着重要的生理功能，与三羧酸循环、氧化磷酸化、脂肪酸代谢、细胞内氧自由基的产生及细胞凋亡等密切相关。进行线粒体蛋白质组学的研
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: 3_5_1_9_1_6_0_7_2
究将可以更好地认识线粒体的功能及其在生命活动中的作用。双向电泳(twodimensional electrophoresis, 2DE)由O′Farrell于1975年创立的，作为蛋白质组研究的核心技术之一，是目前常用的唯一能连续在一块胶上分离某一物种的数千种蛋白质的方法，同时是当前分辨率较高的工具，已在生物学研究方面得到广泛的应用[1]。Millar等(2001)采用双向凝胶电泳技术，对拟南芥培养细胞的线粒体蛋白进行分析，2DE图谱上可分辨出大约100个高丰度线粒体蛋白以及250％低丰度线粒体蛋白[2]。Millar等（2004）利用蛋白质组学技术分析了水稻幼苗在缺氧和有氧条件下线粒体蛋白的差异表达。近年来，不断有应用线粒体差异蛋白质组学对植物雄性不育机理的研究报道[2]。Kristensen等和Millar等通过分析水稻叶片线粒体在氧化处理和缺氧条件下的蛋白质组学变化,明确了线粒体中受氧胁迫调节的重要蛋白质类别[34]。尽管有相关研究是针对植物线粒体蛋白，但我们必须注意的是有关线粒体蛋白质组学主要针对模式植物，如拟南芥[5]和水稻[6]，而对其他植物开展的还较少。
茭白是我国特有的水生蔬菜，是禾本科多年生水生宿根植物，其质地脆嫩、味道鲜美且营养丰富，素有“水中参”的美称[7]。然而，茭白不耐贮藏，采后常温下 3 d 左右就出现组织软化及木纤化等品质劣变现象，商品价值急剧下降[8]。在茭白成熟衰老过程中，能量代谢是维持其生命活动的重要支撑者，而线粒体是真核细胞内一种重要的细胞器，能量代谢的主要场所，在细胞的整个生命活动中起着非常关键的作用 [9]。研究茭白采后品质劣变过程中的线粒体蛋白质组学，对从分子层面深入揭示茭白品质劣变机制具有重要意义。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 实验材料
实验所用茭白为10月和5月上旬成熟的江苏地产露天茭白。
1.1.2 试剂
苯甲基磺酰氟（PMSF）、乙二胺四乙酸（EDTA）、乙二胺四乙酸二钠、固化pH梯度干胶条（IPG，）、二硫苏糖醇（DTT）、碘乙酰胺（IAA）、丙烯酰胺（Arc）、N,N’甲叉双丙烯酰胺（Bis）、二甲氨基丙磺酸（CHAPS）、低熔点琼脂糖、考马斯亮蓝G250等；聚乙烯吡咯烷酮K30（PVP）、三氯乙酸（TCA）、尿素、甘露醇、硫脲、甘氨酸、半胱氨酸、β巯基乙醇（βMe）、十二烷基磺酸钠（SDS）、聚乙二醇辛基苯基醚（Triton X100）、三羟甲基氨基甲烷（Tris）、过硫酸铵、矿物油、Tris平衡酚、四甲基乙二胺（TEMED）、牛血清蛋白（BSA）等。
1.1.3 仪器
高速冷冻离心机（GL20GⅡ上海安亭科学仪器厂上海）；Beckman高速冷冻离心机（AJ30iBeckman公司美国）；Beckman超速冷冻离心机（OptimaL100XPBeckman公司美国）；等电聚焦电泳系统（ProteinI12IEF美国伯乐公司美国）；高重复性高通量大型垂直电泳（EttanDALTTwelveGE061TY7119GEHealthcare美国）；ImageScannerⅢ扫描仪（28907607GEHealthcare美国）；精密电子天平（DJ300北京赛多利斯仪器系统有限公司1州国华电器有限公司常州）；台面式pH/ISE测试仪（Orion86802上海纳锘仪器有限公司美国）；微型旋涡混合仪（XW80A上海沪西分析仪器厂有限公司上海）。
1.2 线粒体蛋白质提取
1.2.1 差速离心
取鲜切的茭白400 g加入800 ml提取液(50 mM pH7.5 TrisHCl，内含0.25 M蔗糖、0.3 M甘露醇、1 mM EDTA、质量分数分别为0.1% BSA、0.5% PVP40、0.1%半胱氨酸或10 mM β巯基乙醇)于4℃匀浆磨碎细胞或者利用液氮进行研磨。然后用四层纱布过滤，滤液在4 ℃下3 000×g离心15 min；取上清液在4℃下14 000×g离心20 min；将沉淀用80 mL洗涤液(10 mM、pH7.2 TrisHCl，内含0.25 M蔗糖、0.3 M甘露醇、1 mM EDTA、0.1%BSA)洗涤，4 ℃、14 000×g 离心20 min，重复洗涤步骤，得到的沉淀即为粗线粒体。添加8 mL裂解液(50 mM pH 7.2 TrisHCl，2% (v/v)β巯基乙醇，1 mM PMSF)后在冰上进行超声波降解，得到线粒体蛋白液。
目录
摘 要 1
关键词 1
Abstract 1
Key words 1
1 材料与方法 2
1.1 材料 2
1.1.1 实验材料 2
1.1.2 试剂 2
1.1.3 仪器： 2
1.2 线粒体蛋白质提取 2
1.2.1 差速离心 2
1.2.2 密度梯度离心 2
1.3 线粒体蛋白的纯化浓缩 3
1.3.1改良酚抽提法 3
1.3.2修改的酚抽法 3
1.4 线粒体蛋白的含量测定 3
1.5双向电泳 3
1.6凝胶的图像采集与分析 3
2 结果与分析 4
2.1不同的提取方法对2DE图的影响 4
2.2 不同纯化方法对蛋白产量的影响 4
2.3 第一向等电聚焦pH范围对2DE效果的影响 4
2.4不同线粒体蛋白上样量对2DE效果的影响 5
3 讨论 6
3.1 线粒体蛋白提取方法 6
3.2 蛋白上样量的选择 6
3.3 IPG胶条pH范围的选择 6
4 结论 6
致谢 7
参考文献： 7
鲜切茭白线粒体蛋白双向电泳体系建立
引言
线粒体是真核生物非常重要的亚细胞器，在生命过程中发挥着重要的生理功能，与三羧酸循环、氧化磷酸化、脂肪酸代谢、细胞内氧自由基的产生及细胞凋亡等密切相关。进行线粒体蛋白质组学的研
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: 3_5_1_9_1_6_0_7_2
究将可以更好地认识线粒体的功能及其在生命活动中的作用。双向电泳(twodimensional electrophoresis, 2DE)由O′Farrell于1975年创立的，作为蛋白质组研究的核心技术之一，是目前常用的唯一能连续在一块胶上分离某一物种的数千种蛋白质的方法，同时是当前分辨率较高的工具，已在生物学研究方面得到广泛的应用[1]。Millar等(2001)采用双向凝胶电泳技术，对拟南芥培养细胞的线粒体蛋白进行分析，2DE图谱上可分辨出大约100个高丰度线粒体蛋白以及250％低丰度线粒体蛋白[2]。Millar等（2004）利用蛋白质组学技术分析了水稻幼苗在缺氧和有氧条件下线粒体蛋白的差异表达。近年来，不断有应用线粒体差异蛋白质组学对植物雄性不育机理的研究报道[2]。Kristensen等和Millar等通过分析水稻叶片线粒体在氧化处理和缺氧条件下的蛋白质组学变化,明确了线粒体中受氧胁迫调节的重要蛋白质类别[34]。尽管有相关研究是针对植物线粒体蛋白，但我们必须注意的是有关线粒体蛋白质组学主要针对模式植物，如拟南芥[5]和水稻[6]，而对其他植物开展的还较少。
茭白是我国特有的水生蔬菜，是禾本科多年生水生宿根植物，其质地脆嫩、味道鲜美且营养丰富，素有“水中参”的美称[7]。然而，茭白不耐贮藏，采后常温下 3 d 左右就出现组织软化及木纤化等品质劣变现象，商品价值急剧下降[8]。在茭白成熟衰老过程中，能量代谢是维持其生命活动的重要支撑者，而线粒体是真核细胞内一种重要的细胞器，能量代谢的主要场所，在细胞的整个生命活动中起着非常关键的作用 [9]。研究茭白采后品质劣变过程中的线粒体蛋白质组学，对从分子层面深入揭示茭白品质劣变机制具有重要意义。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 实验材料
实验所用茭白为10月和5月上旬成熟的江苏地产露天茭白。
1.1.2 试剂
苯甲基磺酰氟（PMSF）、乙二胺四乙酸（EDTA）、乙二胺四乙酸二钠、固化pH梯度干胶条（IPG，）、二硫苏糖醇（DTT）、碘乙酰胺（IAA）、丙烯酰胺（Arc）、N,N’甲叉双丙烯酰胺（Bis）、二甲氨基丙磺酸（CHAPS）、低熔点琼脂糖、考马斯亮蓝G250等；聚乙烯吡咯烷酮K30（PVP）、三氯乙酸（TCA）、尿素、甘露醇、硫脲、甘氨酸、半胱氨酸、β巯基乙醇（βMe）、十二烷基磺酸钠（SDS）、聚乙二醇辛基苯基醚（Triton X100）、三羟甲基氨基甲烷（Tris）、过硫酸铵、矿物油、Tris平衡酚、四甲基乙二胺（TEMED）、牛血清蛋白（BSA）等。
1.1.3 仪器
高速冷冻离心机（GL20GⅡ上海安亭科学仪器厂上海）；Beckman高速冷冻离心机（AJ30iBeckman公司美国）；Beckman超速冷冻离心机（OptimaL100XPBeckman公司美国）；等电聚焦电泳系统（ProteinI12IEF美国伯乐公司美国）；高重复性高通量大型垂直电泳（EttanDALTTwelveGE061TY7119GEHealthcare美国）；ImageScannerⅢ扫描仪（28907607GEHealthcare美国）；精密电子天平（DJ300北京赛多利斯仪器系统有限公司1州国华电器有限公司常州）；台面式pH/ISE测试仪（Orion86802上海纳锘仪器有限公司美国）；微型旋涡混合仪（XW80A上海沪西分析仪器厂有限公司上海）。
1.2 线粒体蛋白质提取
1.2.1 差速离心
取鲜切的茭白400 g加入800 ml提取液(50 mM pH7.5 TrisHCl，内含0.25 M蔗糖、0.3 M甘露醇、1 mM EDTA、质量分数分别为0.1% BSA、0.5% PVP40、0.1%半胱氨酸或10 mM β巯基乙醇)于4℃匀浆磨碎细胞或者利用液氮进行研磨。然后用四层纱布过滤，滤液在4 ℃下3 000×g离心15 min；取上清液在4℃下14 000×g离心20 min；将沉淀用80 mL洗涤液(10 mM、pH7.2 TrisHCl，内含0.25 M蔗糖、0.3 M甘露醇、1 mM EDTA、0.1%BSA)洗涤，4 ℃、14 000×g 离心20 min，重复洗涤步骤，得到的沉淀即为粗线粒体。添加8 mL裂解液(50 mM pH 7.2 TrisHCl，2% (v/v)β巯基乙醇，1 mM PMSF)后在冰上进行超声波降解，得到线粒体蛋白液。
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