大叶冬青苦丁茶中咖啡酰奎尼酸类物质对糖代谢有关酶的抑制效果研究
大叶冬青苦丁茶中咖啡酰奎尼酸类物质对糖代谢有关酶的抑制效果研究[2020050808]
摘要：咖啡酰奎尼酸类化合物是一类由奎尼酸和不同数目的咖啡酸通过酯化反应缩合而成的酚酸类天然化合物,广泛存在于植物之中,具有显著的抗氧化活性，同时对酶有一定的抑制作用。尤其是对人体内糖代谢有关酶的抑制作用，可显著降低血糖水平。本实验主要是研究大叶苦丁茶中咖啡酰奎尼酸类物质（包括六种单体）对葡萄糖苷酶、淀粉酶等糖代谢有关酶的抑制效果，评价大叶冬青苦丁茶的营养保健作用，为进一步开发大叶苦丁茶保健食品提供理论依据。
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关键字:咖啡酰奎尼酸类化合物；葡萄糖苷酶；淀粉酶；抑制
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1材料与方法3
1.1材料与仪器设备3
1.1.1材料 3
1.1.2仪器设备 3
1.2实验方法 3
1.2.1 CQA类物质对淀粉酶的抑制作用 3
1.2.1.1试剂的配制 3
1.2.1.2实验原理 4
1.2.1.3淀粉天青标准曲线绘制 4
1.2.1.4 CQA类物质对淀粉酶的抑制效果 4
1.2.1.5酶促反应动力学 4
1.2.1.6 CQA类物质对淀粉酶的抑制类型 5
1.2.2 CQA类物质对葡萄糖苷酶的抑制作用 5
1.2.2.1试剂的配制 5
1.2.2.2实验原理 5
1.2.2.3标准曲线的绘制 5
1.2.2.4 CQA类物质对葡萄糖苷酶活性的抑制效果 6
1.2.2.5动力学分析 6
1.2.2.6 CQA类物质对葡萄糖苷酶的抑制类型 6
2结果与讨论6
2.1 CQA类物质对淀粉酶的抑制作用6
2.1.1 CQA类物质对淀粉酶的抑制效果 6
2.1.2 CQA类物质对淀粉酶的抑制类型 7
2.2 CQA类物质对葡萄糖苷酶的抑制作用 8
2.2.1 CQA类物质对葡萄糖苷酶的抑制效果 8
2.2.2 CQA类物质对葡萄糖苷酶的抑制类型 9
3讨论11
致谢11
参考文献12
大叶冬青苦丁 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ￥3^5`1^9`1^6^0`7^2$
茶中咖啡酰奎尼酸类物质对糖代谢有关酶的抑制效果研究
引言
苦丁茶是我国南部及西南部民间传统的药用植物，具有清热解毒、生津、提神、益智和抗衰老、调节血压和血脂等功效。黄林芳[9]的研究表明，苦丁茶具有较为明显的减肥作用，服用后，反映机体肥胖程度的增长指标如李氏指数(肥胖指数)、体脂湿重等都有明显下降，此外苦丁茶对高脂营养性所致的小鼠肥胖有预防作用，对已形成肥胖的小鼠有治疗作用，且效果较明显。
苦丁茶冬青苦丁茶中的主要活性物质咖啡酰奎宁酸（Caffeoylquinic acids, CQA）是由奎宁酸和1-3个咖啡酸基团通过酯化缩合而成的酚酸类化合物。CQA是众多植物，如苍耳、金银花、咖啡豆、旋覆花、灯盏花、白花刺参以及山楂等的天然活性成分。CQA在自然界中广泛存在，近年来，植物中CQA的生物活性的研究已成当今的热点问题，这方面的研究报道越来越多， 如孙燕荣等[16]从传统中药旋覆花中提取到了1,5-di-CQA（1,5-O-二咖啡酰奎宁酸），通过体外肝细胞消化酶两步灌注法，探讨了二咖啡酰奎宁酸物质对四氯化碳引起损伤的肝细胞的增殖、凋亡和细胞周期的影响。研究结果表明，1,5-diCQA在7.8-250 mg/L的浓度范围内能够促进损伤的肝细胞增殖，并增强细胞的活力、降低细胞上清液中AST的活性，对细胞凋亡起到抑制作用，从而起到了对肝细胞明显的保护作用。Un-Ho Jin[17]从卫矛科植物中提取出活性多酚组分，纯化后使用NMR和FAB-MS法鉴定出该活性组分中的主要物质是5-CQA（绿原酸），利用XTT检测法和酶谱法探究5-CQA对肝癌细胞Hep3B 的抑制机理，结果证明了5-CQA可以通过抑制基质金属蛋白酶的分泌而抑制肝癌细胞，从而推测出这种卫矛科植物的化学预防癌症功效可能来源于其中的5-CQA。Yoshimi Nakajima[18]等从巴西绿蜂胶中提取出与苦丁茶冬青中相同的咖啡酰奎宁酸类物质：3,4-di-CQA，3,5-di-CQA，绿原酸，以及其特有的香豆酸。之后探究这些提取物对具有神经毒性的视网膜神经节细胞RGC-5的增殖影响，结果证明，蜂胶提取物可以有效地抑制大鼠前脑匀浆的脂质过氧化水平，并且可以RGC-5细胞中胱氨酸的增加，从而起到神经保护作用。N.Chellan[19]等从一种南非灌木Athrixia phylicoides DC.中提取到了植物多酚组分，研究了这种组分的抗Ⅱ型糖尿病作用和改善肥胖的效力。实验使用小鼠成肌细胞C2C12、人张氏肝细胞Chang和小鼠前体脂肪细胞3T3-L1等探究多酚组分的抑制机理。通过分析，该多酚组分中含有绿原酸、一种二咖啡酰奎宁酸（暂未鉴定）以及原儿茶酸等活性物质，并且这种多酚复合物能够对肌肉、肝脏和脂肪组织中的糖代谢平衡起来效果。Ae-Sim Cho[20]等建立了高脂小鼠模型，探究绿原酸的抗肥胖特性及其对脂质新陈代谢的影响。数据显示，绿原酸可以使高脂小数的体重、内脏脂含量、血浆中瘦素蛋白及胰岛素有效下降，并且，小鼠血浆、肝脏和心脏中的甘油三酯水平都有所下降，血浆、脂质组织和心脏中的胆固醇含量也有所下降。王珏等[21]通过组胺抑制实验，在小花鬼针草中寻找到了具有生物活性的化学成分，并探讨了它们的抗炎效果。运用1D NMR和2D NMR波谱法鉴定出该活性化学成分中的6种咖啡酰奎宁酸化合物：3,4-di-CQA、3,5-di-CQA、4,5-di- *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ￥3^5`1^9`1^6^0`7^2$
CQA、3-O-CQA、4-O-CQA及5-O-CQA。
此外，CQA类物质对预防高血压、动脉粥样化也起到重要的作用。波兰科学家Adam Jurgoński R.D.等[22]用富含多酚类物质的莴苣子提取物对32只成年大鼠进行试验，对照组C的大鼠用标准玉米淀粉喂养，而实验组E的大鼠用高剂量的胆固醇和果糖、大豆油建造高脂模型。分别用芦丁和富含CQA类物质的莴苣子醇提物（9.6% CQA，其中Mono-CQA单咖啡酰奎宁酸2.8%，Di-CQA二咖啡酰奎宁酸6.8%）试验各组大鼠（多酚添加量每组都为0.15%）。结果表明，莴苣中的CQA类物质能够减少动脉粥样硬化、提高血液的抗氧化水平。
本实验主要是研究大叶苦丁茶中CQA对葡萄糖苷酶、淀粉酶等糖代谢有关酶的抑制效果，确定其抑制类型，为进一步开发大叶苦丁茶保健食品提供理论依据。
六种咖啡酰奎尼酸类化合物单体详见图1。
图1.六种咖啡酰奎尼酸类化合物结构
Fig1.Structure of six Caffeoyl quinic acid
1 材料与方法
1.1 材料与仪器设备
1.1.1 材料与试剂
咖啡酰奎尼酸单体、淀粉酶、葡萄糖苷酶、对硝基苯 - α -D- 葡萄糖苷（PNPG）、
HYQ-2121A 型旋涡混匀器（苏州捷美电子有限公司）；
Anke TDL-5 低速离心机（上海安亭科学仪器厂）；
固定样品浓度和酶溶液的浓度，改变底物溶液淀粉天青的浓度，反应后，以595处的吸光值A595的倒数为纵坐标，1/[S]为横坐标，绘制CQA类物质的抑制作用动力学曲线，确定它们对淀粉酶的抑制类型。从图5中可以看出，5-CQA、3,4-diCQA、3,5-diCQA及4,5-diCQA对淀粉酶的抑制作用均可以初步确定为非竞争性抑制。另外两种单取代CQA：3-CQA和4-CQA暂不能从此抑制作用动力学曲线确定其抑制类型。
摘要：咖啡酰奎尼酸类化合物是一类由奎尼酸和不同数目的咖啡酸通过酯化反应缩合而成的酚酸类天然化合物,广泛存在于植物之中,具有显著的抗氧化活性，同时对酶有一定的抑制作用。尤其是对人体内糖代谢有关酶的抑制作用，可显著降低血糖水平。本实验主要是研究大叶苦丁茶中咖啡酰奎尼酸类物质（包括六种单体）对葡萄糖苷酶、淀粉酶等糖代谢有关酶的抑制效果，评价大叶冬青苦丁茶的营养保健作用，为进一步开发大叶苦丁茶保健食品提供理论依据。
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关键字:咖啡酰奎尼酸类化合物；葡萄糖苷酶；淀粉酶；抑制
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摘要1
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Abstract1
Key words1
引言1
1材料与方法3
1.1材料与仪器设备3
1.1.1材料 3
1.1.2仪器设备 3
1.2实验方法 3
1.2.1 CQA类物质对淀粉酶的抑制作用 3
1.2.1.1试剂的配制 3
1.2.1.2实验原理 4
1.2.1.3淀粉天青标准曲线绘制 4
1.2.1.4 CQA类物质对淀粉酶的抑制效果 4
1.2.1.5酶促反应动力学 4
1.2.1.6 CQA类物质对淀粉酶的抑制类型 5
1.2.2 CQA类物质对葡萄糖苷酶的抑制作用 5
1.2.2.1试剂的配制 5
1.2.2.2实验原理 5
1.2.2.3标准曲线的绘制 5
1.2.2.4 CQA类物质对葡萄糖苷酶活性的抑制效果 6
1.2.2.5动力学分析 6
1.2.2.6 CQA类物质对葡萄糖苷酶的抑制类型 6
2结果与讨论6
2.1 CQA类物质对淀粉酶的抑制作用6
2.1.1 CQA类物质对淀粉酶的抑制效果 6
2.1.2 CQA类物质对淀粉酶的抑制类型 7
2.2 CQA类物质对葡萄糖苷酶的抑制作用 8
2.2.1 CQA类物质对葡萄糖苷酶的抑制效果 8
2.2.2 CQA类物质对葡萄糖苷酶的抑制类型 9
3讨论11
致谢11
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茶中咖啡酰奎尼酸类物质对糖代谢有关酶的抑制效果研究
引言
苦丁茶是我国南部及西南部民间传统的药用植物，具有清热解毒、生津、提神、益智和抗衰老、调节血压和血脂等功效。黄林芳[9]的研究表明，苦丁茶具有较为明显的减肥作用，服用后，反映机体肥胖程度的增长指标如李氏指数(肥胖指数)、体脂湿重等都有明显下降，此外苦丁茶对高脂营养性所致的小鼠肥胖有预防作用，对已形成肥胖的小鼠有治疗作用，且效果较明显。
苦丁茶冬青苦丁茶中的主要活性物质咖啡酰奎宁酸（Caffeoylquinic acids, CQA）是由奎宁酸和1-3个咖啡酸基团通过酯化缩合而成的酚酸类化合物。CQA是众多植物，如苍耳、金银花、咖啡豆、旋覆花、灯盏花、白花刺参以及山楂等的天然活性成分。CQA在自然界中广泛存在，近年来，植物中CQA的生物活性的研究已成当今的热点问题，这方面的研究报道越来越多， 如孙燕荣等[16]从传统中药旋覆花中提取到了1,5-di-CQA（1,5-O-二咖啡酰奎宁酸），通过体外肝细胞消化酶两步灌注法，探讨了二咖啡酰奎宁酸物质对四氯化碳引起损伤的肝细胞的增殖、凋亡和细胞周期的影响。研究结果表明，1,5-diCQA在7.8-250 mg/L的浓度范围内能够促进损伤的肝细胞增殖，并增强细胞的活力、降低细胞上清液中AST的活性，对细胞凋亡起到抑制作用，从而起到了对肝细胞明显的保护作用。Un-Ho Jin[17]从卫矛科植物中提取出活性多酚组分，纯化后使用NMR和FAB-MS法鉴定出该活性组分中的主要物质是5-CQA（绿原酸），利用XTT检测法和酶谱法探究5-CQA对肝癌细胞Hep3B 的抑制机理，结果证明了5-CQA可以通过抑制基质金属蛋白酶的分泌而抑制肝癌细胞，从而推测出这种卫矛科植物的化学预防癌症功效可能来源于其中的5-CQA。Yoshimi Nakajima[18]等从巴西绿蜂胶中提取出与苦丁茶冬青中相同的咖啡酰奎宁酸类物质：3,4-di-CQA，3,5-di-CQA，绿原酸，以及其特有的香豆酸。之后探究这些提取物对具有神经毒性的视网膜神经节细胞RGC-5的增殖影响，结果证明，蜂胶提取物可以有效地抑制大鼠前脑匀浆的脂质过氧化水平，并且可以RGC-5细胞中胱氨酸的增加，从而起到神经保护作用。N.Chellan[19]等从一种南非灌木Athrixia phylicoides DC.中提取到了植物多酚组分，研究了这种组分的抗Ⅱ型糖尿病作用和改善肥胖的效力。实验使用小鼠成肌细胞C2C12、人张氏肝细胞Chang和小鼠前体脂肪细胞3T3-L1等探究多酚组分的抑制机理。通过分析，该多酚组分中含有绿原酸、一种二咖啡酰奎宁酸（暂未鉴定）以及原儿茶酸等活性物质，并且这种多酚复合物能够对肌肉、肝脏和脂肪组织中的糖代谢平衡起来效果。Ae-Sim Cho[20]等建立了高脂小鼠模型，探究绿原酸的抗肥胖特性及其对脂质新陈代谢的影响。数据显示，绿原酸可以使高脂小数的体重、内脏脂含量、血浆中瘦素蛋白及胰岛素有效下降，并且，小鼠血浆、肝脏和心脏中的甘油三酯水平都有所下降，血浆、脂质组织和心脏中的胆固醇含量也有所下降。王珏等[21]通过组胺抑制实验，在小花鬼针草中寻找到了具有生物活性的化学成分，并探讨了它们的抗炎效果。运用1D NMR和2D NMR波谱法鉴定出该活性化学成分中的6种咖啡酰奎宁酸化合物：3,4-di-CQA、3,5-di-CQA、4,5-di- *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ￥3^5`1^9`1^6^0`7^2$
CQA、3-O-CQA、4-O-CQA及5-O-CQA。
此外，CQA类物质对预防高血压、动脉粥样化也起到重要的作用。波兰科学家Adam Jurgoński R.D.等[22]用富含多酚类物质的莴苣子提取物对32只成年大鼠进行试验，对照组C的大鼠用标准玉米淀粉喂养，而实验组E的大鼠用高剂量的胆固醇和果糖、大豆油建造高脂模型。分别用芦丁和富含CQA类物质的莴苣子醇提物（9.6% CQA，其中Mono-CQA单咖啡酰奎宁酸2.8%，Di-CQA二咖啡酰奎宁酸6.8%）试验各组大鼠（多酚添加量每组都为0.15%）。结果表明，莴苣中的CQA类物质能够减少动脉粥样硬化、提高血液的抗氧化水平。
本实验主要是研究大叶苦丁茶中CQA对葡萄糖苷酶、淀粉酶等糖代谢有关酶的抑制效果，确定其抑制类型，为进一步开发大叶苦丁茶保健食品提供理论依据。
六种咖啡酰奎尼酸类化合物单体详见图1。
图1.六种咖啡酰奎尼酸类化合物结构
Fig1.Structure of six Caffeoyl quinic acid
1 材料与方法
1.1 材料与仪器设备
1.1.1 材料与试剂
咖啡酰奎尼酸单体、淀粉酶、葡萄糖苷酶、对硝基苯 - α -D- 葡萄糖苷（PNPG）、
HYQ-2121A 型旋涡混匀器（苏州捷美电子有限公司）；
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固定样品浓度和酶溶液的浓度，改变底物溶液淀粉天青的浓度，反应后，以595处的吸光值A595的倒数为纵坐标，1/[S]为横坐标，绘制CQA类物质的抑制作用动力学曲线，确定它们对淀粉酶的抑制类型。从图5中可以看出，5-CQA、3,4-diCQA、3,5-diCQA及4,5-diCQA对淀粉酶的抑制作用均可以初步确定为非竞争性抑制。另外两种单取代CQA：3-CQA和4-CQA暂不能从此抑制作用动力学曲线确定其抑制类型。
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