产γ氨基丁酸乳酸菌的紫外诱变
摘要：γ-氨基丁酸(GABA)是一种在自然界广泛存在的非蛋白质氨基酸，具有降血压、镇静安神、免疫调节等多种生理功能，并且许多乳酸菌能够利用谷氨酸脱羧酶催化谷氨酸及其盐类产生GABA。因此对于产GABA乳酸菌的研究有着较好的物质基础和发展前景。乳酸菌合成γ-氨基丁酸是一种经济、安全、环保生产高附加值天然活性物质的重要手段 ，但是其产量有限。所以本研究的目的是采用紫外诱变的方式，对筛选自传统发酵食品的产GABA的乳酸菌进行菌种改良，提高其产GABA的能力，为其进一步的应用及开发相关产品奠定基础。最终获得了一株产γ-氨基丁酸较高的菌株，其GABA产量为1.652g/ml，相比较出发菌株提高了65%，且其具有良好的遗传稳定性。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1 实验处理 2
1.1 实验材料与仪器 2
1.1.1 材料2
1.1.2 试剂2
1.1.3 实验设备选型 2
1.2 实验方法 2
1.2.2 乳酸菌生长曲线的绘制 2
1.2.2 原始菌株的活化 2
1.2.3 乳酸菌的诱变 3
1.2.4 诱变乳酸菌的筛选 3
1.2.5 遗传稳定性检测 3
2实验结果及分析 3
2.1 诱变菌株活化时间的选择 3
2.2 乳酸菌的诱变结果 4
2.2.1 诱变最佳时间的确定4
2.2.2 照射不同时间的单菌落5
2.3 初筛结果 6
2.4 复筛结果 7
2.5 终筛结果 7
2.5.1最大吸收波长的确定7
2.5.2 GABA标品及样品的液相结果8
2.6 遗传稳定性结果8
3 讨论 8
3.1微生物的诱变育种 9
3.2紫外诱变的利弊 9
3.3 筛选方法 9
致谢10
参考文献10
产γ氨基丁酸乳酸菌的紫外诱变
引言
r /> 引言：乳酸菌是发酵糖类主要产物为乳酸的一类无芽孢、革兰氏染色为阳性细菌的总称[1]。凡是能从葡萄糖或乳糖的发酵过程中产生乳酸菌的细菌统称为乳酸菌，这是一群相当庞大的细菌，可以分为18个属，总共有两百多种，排除少数部分，绝大的乳酸菌都是人体内不可缺少的具有重要生理功能菌群，大多存在于人体的肠道内。肠内乳酸菌直接影响着人体的健康已经得到众多生物学家的证实。大量研究资料表明，乳酸菌能促进动物生长，调节胃肠道正常菌群、维持微生态平衡，从而改善胃肠道功能；提高食物消化率和生物效价；降低血清胆固醇，控制内毒素；抑制肠道内腐败菌生长：提高机体免疫力等。乳酸菌通过发酵产生的有机酸、特殊酶系、酸菌素等物质具有特殊生理功能，可刺激组织发育，对机体的营养状态、生理功能、免疫反应和应激反应等产生作用。
γ氨基丁酸(γAminobutyric acid，GABA)也称氨酪酸，是一种天然的功能性非蛋白质氨基酸。它是在丁酸的γ位上有一个氨基，以非结合态的形式存在，极易溶于水，不溶于醇、醚和苯[2]。γ氨基丁酸广泛存在于细菌、真菌、藻类和高等植物中。植物组织中GABA含量通常在0.3μmol/g32.5μmol/g之间。人们从天然食物中摄取的GABA，远远不能满足人体的生理需求。研究表明，GABA与植物在逆境条件下的应激反应有关。对植物性食品原料采用一定的技术处理后，可以使L谷氨酸转化为GABA。它可参与多种新陈代谢活动，具有降血压，调节内分泌，改善脑功能，增强长期记忆等功能[3]。
然而自然界中存在的GABA的含量比较有限，因此人工合成GABA的生产工艺就成为了当前的研究热点。化学合成法多见于专利文献的报道，成本较高，得率较低，并且在生产工艺中使用危险溶剂，甚至是有毒溶剂。因此化学合成法制备的GABA不能用于食品，也不能认为是一种天然的食品添加剂。生物合成法GABA是应用纯粹的微生物技术，通过筛选优良高产的安全菌种，发酵生产GABA制剂，可以认为是天然食品添加剂。而且据报告显示，生物合成法GABA虽然纯度不高，但生物体对GABA的吸收性却比纯度高的化学合成法GABA高很多，因此可以通化学法或生物法进行合成，其中生物法又分为植物富集和微生物发酵两种方法。随着微生物技术的发展，以及乳酸菌、酵母菌、曲霉菌等食品安全级微生物越来越多的在食品工业中的应用，用微生物法制取含有GABA的食品的方法得到了人们的关注并迎来了一股研究高潮[4]。
由于GABA迪欧电化学及紫外、可见光的不灵敏性，导致用直接方法对它进行测定比较困难。关于GABA的测定近年来国内外有氨基酸分析仪测定、酶法[5]、色质联用法、纸电泳比色法、毛细管气相色谱法[6]、放射性受体法[7]、以及高效液相色谱法[8]等，这些方法大多用于医学领域，且价格昂贵，不适用于大量样品的定量分析。在进行高产GABA乳酸菌的筛选中，以及菌株发酵条件的优化中，都要进行大量的GABA定量分析，需要一种更简便、廉价的定量测定方法。
利用乳酸菌合成GABA是一种经济、安全、环保生产高附加值天然活性物质的重要手段，具有合成GABA能力的乳酸菌种类较多且合成能力具有种属差异。因此，本研究的目的是采用紫外诱变的方式，对筛选自传统发酵食品的产GABA的乳酸菌进行菌种改良，提高其产GABA的能力，为其进一步的应用及开发相关产品奠定基础。
1 材料与方法
1．1 实验材料与仪器
1．1．1 材料
菌种：植物乳杆菌M62，大学食品科学与技术学院实验室保藏。
试剂：葡萄糖、蛋白胨、牛肉膏、酵母膏、无水乙酸钠、柠檬酸铵、磷酸氢二钾、硫酸镁、硫酸锰、吐温80、正丁醇、冰醋酸、邻苯二甲醛、茚三酮、β巯基乙醇和硼酸等，试剂级别为分析纯。乙腈和γ氨基丁酸为色谱纯级别。
1．1．2 培养基的配制
MRS培养基：葡萄糖20.0g、蛋白胨10.0g、 牛肉膏10.0g、酵母膏5.0g、无水乙酸钠5.0g、柠檬酸铵2.0g、磷酸氢二钾2.62g、硫酸镁0.58g、硫酸锰0.198g、吐温80 1ml和蒸馏水1000ml。
MRSG培养基：MRS培养基中加入1%的谷氨酸钠。
梯度平板：先将MRS培养基倒入平板，倾斜15°左右放置，待凝固后倒入含一定浓度GABA的MRA培养基，放平后待其凝固。
实验设备选型
TMBL2003电子天平 上海亚津电子科技有限公司
781 磁力搅拌器 金坛市富华仪器有限公司
冰箱 海尔公司
电子万用炉 天津市泰斯特仪器有限公司
SHAB恒温振荡器 金坛市富华仪器有限公司
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1 实验处理 2
1.1 实验材料与仪器 2
1.1.1 材料2
1.1.2 试剂2
1.1.3 实验设备选型 2
1.2 实验方法 2
1.2.2 乳酸菌生长曲线的绘制 2
1.2.2 原始菌株的活化 2
1.2.3 乳酸菌的诱变 3
1.2.4 诱变乳酸菌的筛选 3
1.2.5 遗传稳定性检测 3
2实验结果及分析 3
2.1 诱变菌株活化时间的选择 3
2.2 乳酸菌的诱变结果 4
2.2.1 诱变最佳时间的确定4
2.2.2 照射不同时间的单菌落5
2.3 初筛结果 6
2.4 复筛结果 7
2.5 终筛结果 7
2.5.1最大吸收波长的确定7
2.5.2 GABA标品及样品的液相结果8
2.6 遗传稳定性结果8
3 讨论 8
3.1微生物的诱变育种 9
3.2紫外诱变的利弊 9
3.3 筛选方法 9
致谢10
参考文献10
产γ氨基丁酸乳酸菌的紫外诱变
引言
r /> 引言：乳酸菌是发酵糖类主要产物为乳酸的一类无芽孢、革兰氏染色为阳性细菌的总称[1]。凡是能从葡萄糖或乳糖的发酵过程中产生乳酸菌的细菌统称为乳酸菌，这是一群相当庞大的细菌，可以分为18个属，总共有两百多种，排除少数部分，绝大的乳酸菌都是人体内不可缺少的具有重要生理功能菌群，大多存在于人体的肠道内。肠内乳酸菌直接影响着人体的健康已经得到众多生物学家的证实。大量研究资料表明，乳酸菌能促进动物生长，调节胃肠道正常菌群、维持微生态平衡，从而改善胃肠道功能；提高食物消化率和生物效价；降低血清胆固醇，控制内毒素；抑制肠道内腐败菌生长：提高机体免疫力等。乳酸菌通过发酵产生的有机酸、特殊酶系、酸菌素等物质具有特殊生理功能，可刺激组织发育，对机体的营养状态、生理功能、免疫反应和应激反应等产生作用。
γ氨基丁酸(γAminobutyric acid，GABA)也称氨酪酸，是一种天然的功能性非蛋白质氨基酸。它是在丁酸的γ位上有一个氨基，以非结合态的形式存在，极易溶于水，不溶于醇、醚和苯[2]。γ氨基丁酸广泛存在于细菌、真菌、藻类和高等植物中。植物组织中GABA含量通常在0.3μmol/g32.5μmol/g之间。人们从天然食物中摄取的GABA，远远不能满足人体的生理需求。研究表明，GABA与植物在逆境条件下的应激反应有关。对植物性食品原料采用一定的技术处理后，可以使L谷氨酸转化为GABA。它可参与多种新陈代谢活动，具有降血压，调节内分泌，改善脑功能，增强长期记忆等功能[3]。
然而自然界中存在的GABA的含量比较有限，因此人工合成GABA的生产工艺就成为了当前的研究热点。化学合成法多见于专利文献的报道，成本较高，得率较低，并且在生产工艺中使用危险溶剂，甚至是有毒溶剂。因此化学合成法制备的GABA不能用于食品，也不能认为是一种天然的食品添加剂。生物合成法GABA是应用纯粹的微生物技术，通过筛选优良高产的安全菌种，发酵生产GABA制剂，可以认为是天然食品添加剂。而且据报告显示，生物合成法GABA虽然纯度不高，但生物体对GABA的吸收性却比纯度高的化学合成法GABA高很多，因此可以通化学法或生物法进行合成，其中生物法又分为植物富集和微生物发酵两种方法。随着微生物技术的发展，以及乳酸菌、酵母菌、曲霉菌等食品安全级微生物越来越多的在食品工业中的应用，用微生物法制取含有GABA的食品的方法得到了人们的关注并迎来了一股研究高潮[4]。
由于GABA迪欧电化学及紫外、可见光的不灵敏性，导致用直接方法对它进行测定比较困难。关于GABA的测定近年来国内外有氨基酸分析仪测定、酶法[5]、色质联用法、纸电泳比色法、毛细管气相色谱法[6]、放射性受体法[7]、以及高效液相色谱法[8]等，这些方法大多用于医学领域，且价格昂贵，不适用于大量样品的定量分析。在进行高产GABA乳酸菌的筛选中，以及菌株发酵条件的优化中，都要进行大量的GABA定量分析，需要一种更简便、廉价的定量测定方法。
利用乳酸菌合成GABA是一种经济、安全、环保生产高附加值天然活性物质的重要手段，具有合成GABA能力的乳酸菌种类较多且合成能力具有种属差异。因此，本研究的目的是采用紫外诱变的方式，对筛选自传统发酵食品的产GABA的乳酸菌进行菌种改良，提高其产GABA的能力，为其进一步的应用及开发相关产品奠定基础。
1 材料与方法
1．1 实验材料与仪器
1．1．1 材料
菌种：植物乳杆菌M62，大学食品科学与技术学院实验室保藏。
试剂：葡萄糖、蛋白胨、牛肉膏、酵母膏、无水乙酸钠、柠檬酸铵、磷酸氢二钾、硫酸镁、硫酸锰、吐温80、正丁醇、冰醋酸、邻苯二甲醛、茚三酮、β巯基乙醇和硼酸等，试剂级别为分析纯。乙腈和γ氨基丁酸为色谱纯级别。
1．1．2 培养基的配制
MRS培养基：葡萄糖20.0g、蛋白胨10.0g、 牛肉膏10.0g、酵母膏5.0g、无水乙酸钠5.0g、柠檬酸铵2.0g、磷酸氢二钾2.62g、硫酸镁0.58g、硫酸锰0.198g、吐温80 1ml和蒸馏水1000ml。
MRSG培养基：MRS培养基中加入1%的谷氨酸钠。
梯度平板：先将MRS培养基倒入平板，倾斜15°左右放置，待凝固后倒入含一定浓度GABA的MRA培养基，放平后待其凝固。
实验设备选型
TMBL2003电子天平 上海亚津电子科技有限公司
781 磁力搅拌器 金坛市富华仪器有限公司
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电子万用炉 天津市泰斯特仪器有限公司
SHAB恒温振荡器 金坛市富华仪器有限公司
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