化妆品中醛酮类化合物测定方法研究
化妆品中醛酮类化合物测定方法研究[20200509190200]
摘要：本文研究了化妆品中甲醛和丙酮含量检测的前处理方法。选用了2,4-二硝基苯肼为衍生化试剂，通过高效液相色谱进行测定。用四氢呋喃-水（9:1）提取样品中的甲醛和丙酮，并采用这种前处理步骤，样品处理液与DNPH水溶液在25℃，pH为3.0的条件下反应1h的衍生化效果最好，初步建立了化妆品中甲醛和丙酮含量的高效液相色谱测定方法。结果显示，化妆品样品中甲醛和丙酮的最低检出限为0.27μg/L，在0.4mg/L-50mg/L浓度范围内呈现良好线性，线性相关系数均大于0.9999，加标回收率为83.6-92.3%，相对标准偏差均小于3%。该方法具有简便、快速、准确度高、检出限低等优点，为化妆品中甲醛和丙酮的测定提供理论依据。
关键字：样品前处理；色谱条件；化妆品；醛酮类化合物
Analysis of Carbonyl compound in Cosmetics by High Performance Liquid Chromatography
Student majoring in Food Quality and Safety LIU YiJun
Tutor LV Fengxia WU Zhongping
Abstract：A method by high performance liquid chromatography was established to determine ormaldehyde and acetone after pre-treatment in cosmetics. The results showed that the spiked samples extracted by tetrahydrofuran-water(9:1) can be well separated. The extractions were carried on solid-phase column, and HPLC analysis was performed. The limit of detection(LOD) of formaldehyde and acetone sample was 0.27 μg/L. The linearity was satisfied with concentrations ranging from 0.4 mg/L to 50 mg/L, which correlation coefficients were all above 0.9999. Average recoveries of spiked simples for formaldehyde and acetone ranged from 83.6% to 92.3%. The method is simple, rapid with high accuracy and low detection limit, which provides theoretical basis for the determination of formaldehyde and acetone in cosmetics.
甲醛是化妆品原料中最常用的廉价防腐剂，其防腐特点是不受产品配方中各体系的酸碱影响。化妆品原料中添加微量甲醛，主要目的是防止微生物(细菌、霉菌)的滋生，防止原料变味、发臭。人体接触低浓度的甲醛可引起接触性过敏皮炎，对人体(特别是儿童)的精神系统、免疫系统、肝脏系统都有一定的毒害作用，长期接触易使人患上癌症。[21]丙酮则是在化妆品中经常添加在卸甲水中。
根据2007年卫生部颁发的《化妆品卫生规范》，甲醛属于限制使用的物质。除口腔产品外，化妆品中甲醛的最大允许使用量为0.2％，甲醛禁止用于喷雾产品，指甲硬化剂中甲醛的最大允许使用浓度为5％。除此之外，对于婴幼儿用产品的甲醛含量并未作其他特殊规定。醛酮类羰基化合物的检测方法主要有分光光度法[22-24]、气相色谱法[7-9]、高效液相色谱法[2-5]。醛酮化合物的检测方法中，分光光度法和比色法由于所用仪器简单易操作、成本低，被广泛使用，但其灵敏度低，操作较繁琐。随着经济和科技的迅速发展，气相色谱和高效液相色谱技术日趋成熟，使用范围也越来越广泛，将在有机物的检测中居于主导地位。
《化妆品卫生规范》中常应用乙酸丙酮分光光度法测定化妆品中甲醛,文献中也有用变色酸分光光度法测定化妆品中甲醛,缺陷是该方法易受酚和其他醛类物质的干扰，并且不适用丙酮的检测，缺乏对主要测定技术包括样品的前处理方法、回收率、精确度深入和系统的研究，制约了化妆品中甲醛及其他醛酮类化合物监测工作。本实验参照文献[17]并进行改进，采用快速简便的样品前处理方法，通过对色谱检测条件的研究选择，实现该技术对化妆品中微量甲醛和丙酮快速、准确定量的目的，进而为保障化妆品安全提供理论指导。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 样品 丁家宜透明质酸（HA）保湿原液
1.1.2 试剂 2,4-二硝基苯肼（分析纯）；磷酸盐pH基准粉剂；氢氧化钠(优级纯)；四氢呋喃(分析纯)；乙腈(色谱纯)；二氯甲烷（色谱纯）；浓盐酸（分析纯）；高氯酸。
1.1.3 主要仪器 电子分析天平BS224S赛多利科学仪器有限公司；超声波清洗器KQ-300B昆山市超声波仪器有限公司；纯水机RIOS-5美国密理博（Mllpori）公司；pH计（测量精度±0.02）PB-10北京赛多利斯仪器有限公司；高效液相色谱仪Agilent-U3000美国安捷伦公司
1.2 方法
1.2.1 2,4-二硝基苯肼试剂的纯化 称量5.0g的2,4-二硝基苯肼固体，在通风橱中加入200ml乙腈，煮沸1h。转移上清液至烧杯中，在60℃水浴锅中逐步冷却并保持温度在60℃，直至95%的溶剂蒸发为止，将剩余溶液用胶头滴管吸出，倒入废液缸，再用多于上清液3倍体积的乙腈洗涤晶体两次。转移晶体至另一干净烧杯中，加入200ml乙腈，加热沸腾，在60℃进行重结晶，直至95%溶剂蒸发，重复洗涤过程一次。
取第二次洗涤完晶体的溶液，用乙腈稀释十倍，每100ml乙腈溶液加入1ml高氯酸（3.8mol/L）后用高效液相色谱进行分析。
将纯化后的2,4-二硝基苯肼固体密封保存在玻璃瓶中，并用胶带密封。
1.2.2 标准物质的制备
1.2.2.1 甲醛-DNPH的制备 向500ml锥形瓶中加入189ml的2,4-二硝基苯肼溶液和3.5ml的甲醛衍生化反应准备液，混匀，再加入磷酸盐缓冲液0.4ml，用6mol/L Hcl和6mol/L氢氧化钠溶液调节pH至3.0，密封，在40℃水浴锅中反应1h。反应结束后，将反应液过滤，留下固体，并用滤液洗涤锥形瓶，洗涤液再次过滤，如此重复3次，最后将滤液倒入废液缸，用重蒸蒸馏水洗涤固体2-3次，使水分蒸发干后得到干燥纯净的甲醛-DNPH固体。
1.2.2.2 丙酮-DNPH的制备 向500ml锥形瓶中加入166ml的2,4-二硝基苯肼溶液和3.0ml的丙酮衍生化反应准备液，混匀，再加入磷酸盐缓冲液0.4ml，用6mol/L盐酸和6mol/L氢氧化钠溶液调节pH至3.0，密封，在40℃水浴锅中反应1h。反应结束后，将反应液过滤，留下固体，并用滤液洗涤锥形瓶，洗涤液再次过滤，如此重复3次，最后将滤液倒入废液缸，用重蒸蒸馏水洗涤固体2-3次，使水分蒸发干后得到干燥纯净的丙酮-DNPH固体。
1.2.3 溶液的配制
1.2.3.1 甲醛衍生化反应准备液 准确移取1.0ml甲醛至100ml容量瓶中，用重蒸蒸馏水定容，得到丙酮衍生化反应准备液。
1.2.3.2 丙酮衍生化反应准备液 准确移取1.0ml丙酮至100ml容量瓶中，用重蒸蒸馏水定容，得到丙酮衍生化反应准备液。
1.2.3.3 2,4-二硝基苯肼溶液（500mg/L） 准确称量500mg的2,4-二硝基苯肼固体，准确至0.1mg，在烧杯中，加入浓盐酸加热溶解后，用重整蒸馏水定容到1L，使用二氯甲烷/正己烷(30/70)50mL萃取两次。弃去有机层。得到500mg/L的2,4-二硝基苯肼溶液，将萃取后的吸收液密封保存于冰箱中,最好现用现配。
1.2.3.4 3.8mol/L高氯酸溶液 移取19ml的高氯酸溶液，用重整蒸馏水定容到50ml容量瓶中，得到3.8mol/L的高氯酸溶液。
1.2.3.5 6mol/L盐酸溶液 移取49.5ml的浓盐酸，用重蒸蒸馏水定容至100ml容量瓶中，得到6mol/L的盐酸溶液
1.2.3.6 6mol/L氢氧化钠溶液 准确称量24.0g的氢氧化钠固体溶解后定容至100ml容量瓶中，得到6mol/L的氢氧化钠溶液
1.2.3.7 磷酸盐缓冲溶液 磷酸盐缓冲溶液:2 5℃,pH=6.86土0.02,用混合磷酸盐PH基准粉剂配制。
1.2.4 化妆品样品前处理 准确称取约1.0g的样品,加入10ml四氢呋喃一水(9:1)溶解,涡旋混匀。
1.2.5 样品测定 准确移取1.0ml的样品溶液,加入2,4一二硝基阱溶液0.2ml,涡旋混合lm in,加入磷酸盐缓冲溶液0.4 ml再用6mol/L盐酸溶液和6mol/L的氢氧化钠溶液调节pH至3.0,室温下反应1h，用四氢呋喃-水(9:1)稀释至5.0ml,混匀,用0.45μm针筒式微孔滤膜过滤器过滤。在已选定好的色谱条件下进样分析。
1.2.6 色谱条件
色谱柱：stable bond C18柱
流动相:乙睛一水(40+60)
流速:1ml/min
紫外检测波长:360nm
柱温:室温
进样量：10μL
1.2.7 标准曲线的绘制
1.2.7.1 甲醛-DNPH标准曲线绘制 称量约50 mg甲醛的2，4-二硝基苯腙衍生化合物，精确至0.1mg，转移至100 mL容量瓶中，乙腈定容至刻度，得标准储备液：移取10 mL标准储备液至50 mL容量瓶中，乙腈定容至刻度，得一级标准溶液；再分别移取0．1，0．2，0．5，1，5，12，25 mL一级标准溶液至50 mL容量瓶中，乙腈定容至刻度，得系列标准溶液。各浓度的甲醛标准溶液经过衍生化后，进行高效液相色谱紫外检测，根据样品的保留时间定性，以峰面积为纵坐标，以甲醛浓度为横坐标，绘制标准曲线如图1所示。线性方程为Y=0.1525+19.289X，线性相关系数为1.0000。
图1甲醛-DNPH标准曲线
1.2.7.2 丙酮-DNPH标准曲线绘制 称量约50 mg丙酮的2，4-二硝基苯腙衍生化合物，精确至0.1mg，转移至100 mL容量瓶中，乙腈定容至刻度，得标准储备液：移取10 mL标准储备液至50 mL容量瓶中，乙腈定容至刻度，得一级标准溶液；再分别移取0．1，0．2，0．5，1，5，15，25 mL一级标准溶液至50 mL容量瓶中，乙腈定容至刻度，得系列标准溶液。各浓度的丙酮标准溶液经过衍生化后，进行高效液相色谱紫外检测，根据样品的保留时间定性，以峰面积为纵坐标，以甲醛浓度为横坐标，绘制标准曲线如图2所示。线性方程为Y=1.0636+41.507 X，线性相关系数为0.9999。
图2丙酮-DNPH标准曲线
该方法线性关系良好，能够准确进行定量。
2 结果与分析
2.1 色谱条件选择
2.1.1 流动相选择 选择乙睛与水的混合溶剂作为流动相,避免了甲醇的干扰，并对乙睛与水的配比进行了选择，改变乙睛与水的配比，会改变衍生试剂与甲醛衍生物的分离度。本实验确定乙睛与水的配比为40:60，采用乙腈：水=40:60的比例可以有效地将甲醛及丙酮的衍生物与衍生试剂分开，结果如图3、4、5、6所示。
从图3中可以看出，甲醛的2，4-二硝基苯腙保留时间在7.322min左右。从图5中可以看出，丙酮的2,4-二硝基苯腙保留时间在12.523min左右，从图4和图6中可以看出2，4-二硝基苯肼保留时间在4.688min左右。
综合图3-图6,可看出HPLC色谱峰峰形尖锐，对称性好，可满足甲醛、丙酮的检测分离要求。
图3甲醛标准溶液的高效液相色谱图
图4化妆品样品加甲醛-DNPH色谱图
图5丙酮标准溶液的高效液相色谱图
图6化妆品样品加丙酮-DNPH色谱图
2.2 衍生萃取条件的选择
2.2.1 衍生剂用量的选择 准确移取样品加甲醛和样品加丙酮后的处理液1.0ml，改变衍生剂用量，分别为0.1、0.15、0.2、0.25、0.3、0.4、0.5ml,按前面方法进行反应，比较不同衍生剂用量下甲醛和丙酮衍生物吸光度大小。实验结果见表1,衍生试剂用量在0.2ml时,增加衍生剂的用量甲醛和丙酮衍生物吸光度无显著性差异,本实验确定衍生剂用量为0.2ml。
表1衍生剂用量选择
衍生剂用量(mL)0.10.150.20.250.30.40.5
甲醛-DNPH（mAU）1442.91463.21492.51487.61495.31486.71482.8
丙酮-DNPH（mAU）1047.61093.81134.61132.41135.21130.51133.3
2.2.2 涡旋萃取时间选择 在相同实验条件下,改变涡旋萃取时间分别为1min、2min、3min、4min，实验结果见表2。从表2可以看出，在不同涡旋萃取时间下,甲醛及丙酮衍生物吸光度无显著性差异,本实验确定涡旋萃取时间为1min。
表2涡旋萃取时间选择
涡旋萃取时间（min） 1 2 3 4
甲醛-DNPH（mAU） 1492.5 1489.7 1493.2 1490.9
丙酮-DNPH（mAU） 1134.6 1130.2 1133.9 1135.4
2.2.3 衍生化反应温度的选择 在相同实验条件下，分别在25℃和40℃水浴条件下反应1h，结果见表3。在25℃条件下甲醛及丙酮衍生物吸光度明显高于在同样条件下40℃水浴反应的样品，因此本实验确定衍生化反应温度为25℃。
表3反应温度的选择
所添加的标准物质 甲醛 丙酮
反应温度（℃） 25 40 25 40
组次 1 2 1 2 1 2 1 2
甲醛-DNPH（mAU） 1493.5 1483.6 1208.8 1264.6 1109.2 1134.2 958.4 939.5
丙酮-DNPH（mAU） 44.6 43.4 50.3 52.7 63.7 64.5 56.6 59.6
2.3 方法回收率和精密度
采用添加浓度分别为0.3ppm，0.5ppm，1.0ppm每个水平做6个平行，测定甲醛和丙酮含量，计算回收率和相对标准偏差，结果见表4。从表4可算出，方法回收率为83.6%～92.3%，相对标准偏差均小于3%，表明该实验方法有较高的回收率和精密度。
表4添加回收率和相对标准偏差（RSD）
样品名称甲醛丙酮
样品添加浓度（ppm）0.30.51.00.30.51.0
11154.61075.710851617.71442.11415.6
21137.71063.21076.91593.21422.71395.4
31122.11050.41069.51571.91391.31386.1
41106.11038.71061.11539.11371.61368.1
51091.11028.11053.31525.71352.41340.8
610771017.61046.41503.61333.31324.9
RSD(%)2.602.081.362.803.002.49
添加回收率(%)83.685.789.992.387.291.8
2.4 检出限
采用空白样品加标实验和3倍信噪比（S/N）的方法计算，本方法对于甲醛和丙酮的检出限分别为0.27μg/L和0.28μg/L。
2.5 样品测定结果
样品经HPLC检测，结果如图7所示。从图7中可看出，样品在7.3min左右有峰，可判断含有甲。经计算，在15ml的化妆品样品中甲醛的量为16μg，即浓度为0.11%。
图7空白样品不加标准物质色谱图
3 讨论
本实验采用2,4-DNPH衍生HPLC法测量化妆品样品中甲醛及丙酮含量。完善了样品前处理、DNPH纯化方法，相关标准物质制备的反应用量，衍生化反应条件以及高效液相色谱的测定条件。样品前处理用四氢呋喃-水（9:1）提取，处理液与DNPH溶液在25℃，pH=3的条件下反应1h。经检测，样品中不含丙酮，甲醛的含量是0.11%。根据2007年卫生部颁发的《化妆品卫生规范》，化妆品中甲醛的最大允许使用量为0.2％。因此，本次测定的样品属于合格产品。其中微量的甲醛有可能来自于原料，也有可能来自于环境。实验通过衍生介质和试剂的选择避免了试剂干扰且增加了分析物的稳定性。本方法具有重现性高、精密度高、试剂干扰少等优点，可满足目前的检测要求。
文献报道的醛酮类化合物的测定主要有变色酸比色法(李文明[24]用变酸比色法测定水发产品中甲醛的含量)、高效液相色谱法(姜荻[1]用HPLC法测定空气中的醛酮类化合物，马敬军[2]用HPLC法测水产品中醛酮类化合物，张艳妮[3]用HPLC法测车内空气中的醛酮类化合物)、气相色谱法(张婷婷[7]用气相色谱法测地表水中醛酮类化合物，王磊[8]用气相色谱法测水中醛酮类化合物)等，这些方法主要应用于空气、海水、食品中甲醛酮类化合物的测定。而化妆品中一般采用乙酰丙酮法测定甲醛的含量，该方法易受酚和其他醛类物质的干扰，并且不适用丙酮及其他醛酮类化合物的检测，制约了化妆品中甲醛及其他醛酮类化合物监测工作。因此本文在文献基础上进行改进，采用快速简便的样品前处理方法，通过对色谱检测条件的研究选择，实现该技术对化妆品中微量甲醛和丙酮快速、准确定量的目的，进而为保障化妆品安全提供依据。
4 结论
本实验采用了四氢呋喃-水（9:1）提取样品，方法简便提取效率高。同时，这种方法的可行性经过HPLC的确证，色谱分析无干扰峰而且回收率稳定，重现性好。本文在这种前处理方法的基础上建立了化妆品中中甲醛和丙酮含量的高效液相色谱测定方法。该方法具有操作简单，灵敏度高，测定周期短等优点，明显提高了检测效率，适用于化妆品中中甲醛和丙酮含量的的检测。
致谢
参考文献:
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*好棒文|www.hbsrm.com +Q: *351916072*
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摘要 1
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Abstract 1
Key words 1
引言 1
1 材料与方法 2
1.1 材料 2
1.1.1 样品 2
1.1.2 试剂 2
1.1.3 主要仪器 2
1.2 方法 2
1.2.1 2,4-二硝基苯肼试剂的纯化 2
1.2.2 标准物质的制备 2
1.2.2.1 甲醛-DNPH的制备 2
1.2.2.2 丙酮-DNPH的制备 2
1.2.3 溶液的配制 3
1.2.3.1 甲醛衍生化反应准备液 3
1.2.3.2 丙酮衍生化反应准备液 3
1.2.3.3 2,4-二硝基苯肼溶液（500mg/L） 3
1.2.3.4 3.8mol/L高氯酸溶液 3
1.2.3.5 6mol/L盐酸溶液 3
1.2.3.6 6mol/L氢氧化钠溶液 3
1.2.3.7 磷酸盐缓冲溶液 3
1.2.4 化妆品样品前处理 3
1.2.5 样品测定 3
1.2.6 色谱条件 3
1.2.7 标准曲线的绘制 3
1.2.7.1 甲醛-DNPH标准曲线绘制 3
1.2.7.2 丙酮-DNPH标准曲线绘制 4
2 结果与分析 4
2.1 色谱条件选择 4
2.1.1 流动相选择 4
2.2 衍生萃取条件的选择 6
2.2.1 衍生剂用量的选 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: *351916072*
择 6
2.2.2 涡旋萃取时间选择 6
2.2.3 衍生化反应温度的选择 6
2.3 方法回收率和精密度 7
2.4 检出限 7
2.5 样品测定结果 7
3 讨论 8
4 结论 8
致谢 8
参考文献 9
化妆品中醛酮类化合物测定方法研究
引言
引言
摘要：本文研究了化妆品中甲醛和丙酮含量检测的前处理方法。选用了2,4-二硝基苯肼为衍生化试剂，通过高效液相色谱进行测定。用四氢呋喃-水（9:1）提取样品中的甲醛和丙酮，并采用这种前处理步骤，样品处理液与DNPH水溶液在25℃，pH为3.0的条件下反应1h的衍生化效果最好，初步建立了化妆品中甲醛和丙酮含量的高效液相色谱测定方法。结果显示，化妆品样品中甲醛和丙酮的最低检出限为0.27μg/L，在0.4mg/L-50mg/L浓度范围内呈现良好线性，线性相关系数均大于0.9999，加标回收率为83.6-92.3%，相对标准偏差均小于3%。该方法具有简便、快速、准确度高、检出限低等优点，为化妆品中甲醛和丙酮的测定提供理论依据。
关键字：样品前处理；色谱条件；化妆品；醛酮类化合物
Analysis of Carbonyl compound in Cosmetics by High Performance Liquid Chromatography
Student majoring in Food Quality and Safety LIU YiJun
Tutor LV Fengxia WU Zhongping
Abstract：A method by high performance liquid chromatography was established to determine ormaldehyde and acetone after pre-treatment in cosmetics. The results showed that the spiked samples extracted by tetrahydrofuran-water(9:1) can be well separated. The extractions were carried on solid-phase column, and HPLC analysis was performed. The limit of detection(LOD) of formaldehyde and acetone sample was 0.27 μg/L. The linearity was satisfied with concentrations ranging from 0.4 mg/L to 50 mg/L, which correlation coefficients were all above 0.9999. Average recoveries of spiked simples for formaldehyde and acetone ranged from 83.6% to 92.3%. The method is simple, rapid with high accuracy and low detection limit, which provides theoretical basis for the determination of formaldehyde and acetone in cosmetics.
甲醛是化妆品原料中最常用的廉价防腐剂，其防腐特点是不受产品配方中各体系的酸碱影响。化妆品原料中添加微量甲醛，主要目的是防止微生物(细菌、霉菌)的滋生，防止原料变味、发臭。人体接触低浓度的甲醛可引起接触性过敏皮炎，对人体(特别是儿童)的精神系统、免疫系统、肝脏系统都有一定的毒害作用，长期接触易使人患上癌症。[21]丙酮则是在化妆品中经常添加在卸甲水中。
根据2007年卫生部颁发的《化妆品卫生规范》，甲醛属于限制使用的物质。除口腔产品外，化妆品中甲醛的最大允许使用量为0.2％，甲醛禁止用于喷雾产品，指甲硬化剂中甲醛的最大允许使用浓度为5％。除此之外，对于婴幼儿用产品的甲醛含量并未作其他特殊规定。醛酮类羰基化合物的检测方法主要有分光光度法[22-24]、气相色谱法[7-9]、高效液相色谱法[2-5]。醛酮化合物的检测方法中，分光光度法和比色法由于所用仪器简单易操作、成本低，被广泛使用，但其灵敏度低，操作较繁琐。随着经济和科技的迅速发展，气相色谱和高效液相色谱技术日趋成熟，使用范围也越来越广泛，将在有机物的检测中居于主导地位。
《化妆品卫生规范》中常应用乙酸丙酮分光光度法测定化妆品中甲醛,文献中也有用变色酸分光光度法测定化妆品中甲醛,缺陷是该方法易受酚和其他醛类物质的干扰，并且不适用丙酮的检测，缺乏对主要测定技术包括样品的前处理方法、回收率、精确度深入和系统的研究，制约了化妆品中甲醛及其他醛酮类化合物监测工作。本实验参照文献[17]并进行改进，采用快速简便的样品前处理方法，通过对色谱检测条件的研究选择，实现该技术对化妆品中微量甲醛和丙酮快速、准确定量的目的，进而为保障化妆品安全提供理论指导。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 样品 丁家宜透明质酸（HA）保湿原液
1.1.2 试剂 2,4-二硝基苯肼（分析纯）；磷酸盐pH基准粉剂；氢氧化钠(优级纯)；四氢呋喃(分析纯)；乙腈(色谱纯)；二氯甲烷（色谱纯）；浓盐酸（分析纯）；高氯酸。
1.1.3 主要仪器 电子分析天平BS224S赛多利科学仪器有限公司；超声波清洗器KQ-300B昆山市超声波仪器有限公司；纯水机RIOS-5美国密理博（Mllpori）公司；pH计（测量精度±0.02）PB-10北京赛多利斯仪器有限公司；高效液相色谱仪Agilent-U3000美国安捷伦公司
1.2 方法
1.2.1 2,4-二硝基苯肼试剂的纯化 称量5.0g的2,4-二硝基苯肼固体，在通风橱中加入200ml乙腈，煮沸1h。转移上清液至烧杯中，在60℃水浴锅中逐步冷却并保持温度在60℃，直至95%的溶剂蒸发为止，将剩余溶液用胶头滴管吸出，倒入废液缸，再用多于上清液3倍体积的乙腈洗涤晶体两次。转移晶体至另一干净烧杯中，加入200ml乙腈，加热沸腾，在60℃进行重结晶，直至95%溶剂蒸发，重复洗涤过程一次。
取第二次洗涤完晶体的溶液，用乙腈稀释十倍，每100ml乙腈溶液加入1ml高氯酸（3.8mol/L）后用高效液相色谱进行分析。
将纯化后的2,4-二硝基苯肼固体密封保存在玻璃瓶中，并用胶带密封。
1.2.2 标准物质的制备
1.2.2.1 甲醛-DNPH的制备 向500ml锥形瓶中加入189ml的2,4-二硝基苯肼溶液和3.5ml的甲醛衍生化反应准备液，混匀，再加入磷酸盐缓冲液0.4ml，用6mol/L Hcl和6mol/L氢氧化钠溶液调节pH至3.0，密封，在40℃水浴锅中反应1h。反应结束后，将反应液过滤，留下固体，并用滤液洗涤锥形瓶，洗涤液再次过滤，如此重复3次，最后将滤液倒入废液缸，用重蒸蒸馏水洗涤固体2-3次，使水分蒸发干后得到干燥纯净的甲醛-DNPH固体。
1.2.2.2 丙酮-DNPH的制备 向500ml锥形瓶中加入166ml的2,4-二硝基苯肼溶液和3.0ml的丙酮衍生化反应准备液，混匀，再加入磷酸盐缓冲液0.4ml，用6mol/L盐酸和6mol/L氢氧化钠溶液调节pH至3.0，密封，在40℃水浴锅中反应1h。反应结束后，将反应液过滤，留下固体，并用滤液洗涤锥形瓶，洗涤液再次过滤，如此重复3次，最后将滤液倒入废液缸，用重蒸蒸馏水洗涤固体2-3次，使水分蒸发干后得到干燥纯净的丙酮-DNPH固体。
1.2.3 溶液的配制
1.2.3.1 甲醛衍生化反应准备液 准确移取1.0ml甲醛至100ml容量瓶中，用重蒸蒸馏水定容，得到丙酮衍生化反应准备液。
1.2.3.2 丙酮衍生化反应准备液 准确移取1.0ml丙酮至100ml容量瓶中，用重蒸蒸馏水定容，得到丙酮衍生化反应准备液。
1.2.3.3 2,4-二硝基苯肼溶液（500mg/L） 准确称量500mg的2,4-二硝基苯肼固体，准确至0.1mg，在烧杯中，加入浓盐酸加热溶解后，用重整蒸馏水定容到1L，使用二氯甲烷/正己烷(30/70)50mL萃取两次。弃去有机层。得到500mg/L的2,4-二硝基苯肼溶液，将萃取后的吸收液密封保存于冰箱中,最好现用现配。
1.2.3.4 3.8mol/L高氯酸溶液 移取19ml的高氯酸溶液，用重整蒸馏水定容到50ml容量瓶中，得到3.8mol/L的高氯酸溶液。
1.2.3.5 6mol/L盐酸溶液 移取49.5ml的浓盐酸，用重蒸蒸馏水定容至100ml容量瓶中，得到6mol/L的盐酸溶液
1.2.3.6 6mol/L氢氧化钠溶液 准确称量24.0g的氢氧化钠固体溶解后定容至100ml容量瓶中，得到6mol/L的氢氧化钠溶液
1.2.3.7 磷酸盐缓冲溶液 磷酸盐缓冲溶液:2 5℃,pH=6.86土0.02,用混合磷酸盐PH基准粉剂配制。
1.2.4 化妆品样品前处理 准确称取约1.0g的样品,加入10ml四氢呋喃一水(9:1)溶解,涡旋混匀。
1.2.5 样品测定 准确移取1.0ml的样品溶液,加入2,4一二硝基阱溶液0.2ml,涡旋混合lm in,加入磷酸盐缓冲溶液0.4 ml再用6mol/L盐酸溶液和6mol/L的氢氧化钠溶液调节pH至3.0,室温下反应1h，用四氢呋喃-水(9:1)稀释至5.0ml,混匀,用0.45μm针筒式微孔滤膜过滤器过滤。在已选定好的色谱条件下进样分析。
1.2.6 色谱条件
色谱柱：stable bond C18柱
流动相:乙睛一水(40+60)
流速:1ml/min
紫外检测波长:360nm
柱温:室温
进样量：10μL
1.2.7 标准曲线的绘制
1.2.7.1 甲醛-DNPH标准曲线绘制 称量约50 mg甲醛的2，4-二硝基苯腙衍生化合物，精确至0.1mg，转移至100 mL容量瓶中，乙腈定容至刻度，得标准储备液：移取10 mL标准储备液至50 mL容量瓶中，乙腈定容至刻度，得一级标准溶液；再分别移取0．1，0．2，0．5，1，5，12，25 mL一级标准溶液至50 mL容量瓶中，乙腈定容至刻度，得系列标准溶液。各浓度的甲醛标准溶液经过衍生化后，进行高效液相色谱紫外检测，根据样品的保留时间定性，以峰面积为纵坐标，以甲醛浓度为横坐标，绘制标准曲线如图1所示。线性方程为Y=0.1525+19.289X，线性相关系数为1.0000。
图1甲醛-DNPH标准曲线
1.2.7.2 丙酮-DNPH标准曲线绘制 称量约50 mg丙酮的2，4-二硝基苯腙衍生化合物，精确至0.1mg，转移至100 mL容量瓶中，乙腈定容至刻度，得标准储备液：移取10 mL标准储备液至50 mL容量瓶中，乙腈定容至刻度，得一级标准溶液；再分别移取0．1，0．2，0．5，1，5，15，25 mL一级标准溶液至50 mL容量瓶中，乙腈定容至刻度，得系列标准溶液。各浓度的丙酮标准溶液经过衍生化后，进行高效液相色谱紫外检测，根据样品的保留时间定性，以峰面积为纵坐标，以甲醛浓度为横坐标，绘制标准曲线如图2所示。线性方程为Y=1.0636+41.507 X，线性相关系数为0.9999。
图2丙酮-DNPH标准曲线
该方法线性关系良好，能够准确进行定量。
2 结果与分析
2.1 色谱条件选择
2.1.1 流动相选择 选择乙睛与水的混合溶剂作为流动相,避免了甲醇的干扰，并对乙睛与水的配比进行了选择，改变乙睛与水的配比，会改变衍生试剂与甲醛衍生物的分离度。本实验确定乙睛与水的配比为40:60，采用乙腈：水=40:60的比例可以有效地将甲醛及丙酮的衍生物与衍生试剂分开，结果如图3、4、5、6所示。
从图3中可以看出，甲醛的2，4-二硝基苯腙保留时间在7.322min左右。从图5中可以看出，丙酮的2,4-二硝基苯腙保留时间在12.523min左右，从图4和图6中可以看出2，4-二硝基苯肼保留时间在4.688min左右。
综合图3-图6,可看出HPLC色谱峰峰形尖锐，对称性好，可满足甲醛、丙酮的检测分离要求。
图3甲醛标准溶液的高效液相色谱图
图4化妆品样品加甲醛-DNPH色谱图
图5丙酮标准溶液的高效液相色谱图
图6化妆品样品加丙酮-DNPH色谱图
2.2 衍生萃取条件的选择
2.2.1 衍生剂用量的选择 准确移取样品加甲醛和样品加丙酮后的处理液1.0ml，改变衍生剂用量，分别为0.1、0.15、0.2、0.25、0.3、0.4、0.5ml,按前面方法进行反应，比较不同衍生剂用量下甲醛和丙酮衍生物吸光度大小。实验结果见表1,衍生试剂用量在0.2ml时,增加衍生剂的用量甲醛和丙酮衍生物吸光度无显著性差异,本实验确定衍生剂用量为0.2ml。
表1衍生剂用量选择
衍生剂用量(mL)0.10.150.20.250.30.40.5
甲醛-DNPH（mAU）1442.91463.21492.51487.61495.31486.71482.8
丙酮-DNPH（mAU）1047.61093.81134.61132.41135.21130.51133.3
2.2.2 涡旋萃取时间选择 在相同实验条件下,改变涡旋萃取时间分别为1min、2min、3min、4min，实验结果见表2。从表2可以看出，在不同涡旋萃取时间下,甲醛及丙酮衍生物吸光度无显著性差异,本实验确定涡旋萃取时间为1min。
表2涡旋萃取时间选择
涡旋萃取时间（min） 1 2 3 4
甲醛-DNPH（mAU） 1492.5 1489.7 1493.2 1490.9
丙酮-DNPH（mAU） 1134.6 1130.2 1133.9 1135.4
2.2.3 衍生化反应温度的选择 在相同实验条件下，分别在25℃和40℃水浴条件下反应1h，结果见表3。在25℃条件下甲醛及丙酮衍生物吸光度明显高于在同样条件下40℃水浴反应的样品，因此本实验确定衍生化反应温度为25℃。
表3反应温度的选择
所添加的标准物质 甲醛 丙酮
反应温度（℃） 25 40 25 40
组次 1 2 1 2 1 2 1 2
甲醛-DNPH（mAU） 1493.5 1483.6 1208.8 1264.6 1109.2 1134.2 958.4 939.5
丙酮-DNPH（mAU） 44.6 43.4 50.3 52.7 63.7 64.5 56.6 59.6
2.3 方法回收率和精密度
采用添加浓度分别为0.3ppm，0.5ppm，1.0ppm每个水平做6个平行，测定甲醛和丙酮含量，计算回收率和相对标准偏差，结果见表4。从表4可算出，方法回收率为83.6%～92.3%，相对标准偏差均小于3%，表明该实验方法有较高的回收率和精密度。
表4添加回收率和相对标准偏差（RSD）
样品名称甲醛丙酮
样品添加浓度（ppm）0.30.51.00.30.51.0
11154.61075.710851617.71442.11415.6
21137.71063.21076.91593.21422.71395.4
31122.11050.41069.51571.91391.31386.1
41106.11038.71061.11539.11371.61368.1
51091.11028.11053.31525.71352.41340.8
610771017.61046.41503.61333.31324.9
RSD(%)2.602.081.362.803.002.49
添加回收率(%)83.685.789.992.387.291.8
2.4 检出限
采用空白样品加标实验和3倍信噪比（S/N）的方法计算，本方法对于甲醛和丙酮的检出限分别为0.27μg/L和0.28μg/L。
2.5 样品测定结果
样品经HPLC检测，结果如图7所示。从图7中可看出，样品在7.3min左右有峰，可判断含有甲。经计算，在15ml的化妆品样品中甲醛的量为16μg，即浓度为0.11%。
图7空白样品不加标准物质色谱图
3 讨论
本实验采用2,4-DNPH衍生HPLC法测量化妆品样品中甲醛及丙酮含量。完善了样品前处理、DNPH纯化方法，相关标准物质制备的反应用量，衍生化反应条件以及高效液相色谱的测定条件。样品前处理用四氢呋喃-水（9:1）提取，处理液与DNPH溶液在25℃，pH=3的条件下反应1h。经检测，样品中不含丙酮，甲醛的含量是0.11%。根据2007年卫生部颁发的《化妆品卫生规范》，化妆品中甲醛的最大允许使用量为0.2％。因此，本次测定的样品属于合格产品。其中微量的甲醛有可能来自于原料，也有可能来自于环境。实验通过衍生介质和试剂的选择避免了试剂干扰且增加了分析物的稳定性。本方法具有重现性高、精密度高、试剂干扰少等优点，可满足目前的检测要求。
文献报道的醛酮类化合物的测定主要有变色酸比色法(李文明[24]用变酸比色法测定水发产品中甲醛的含量)、高效液相色谱法(姜荻[1]用HPLC法测定空气中的醛酮类化合物，马敬军[2]用HPLC法测水产品中醛酮类化合物，张艳妮[3]用HPLC法测车内空气中的醛酮类化合物)、气相色谱法(张婷婷[7]用气相色谱法测地表水中醛酮类化合物，王磊[8]用气相色谱法测水中醛酮类化合物)等，这些方法主要应用于空气、海水、食品中甲醛酮类化合物的测定。而化妆品中一般采用乙酰丙酮法测定甲醛的含量，该方法易受酚和其他醛类物质的干扰，并且不适用丙酮及其他醛酮类化合物的检测，制约了化妆品中甲醛及其他醛酮类化合物监测工作。因此本文在文献基础上进行改进，采用快速简便的样品前处理方法，通过对色谱检测条件的研究选择，实现该技术对化妆品中微量甲醛和丙酮快速、准确定量的目的，进而为保障化妆品安全提供依据。
4 结论
本实验采用了四氢呋喃-水（9:1）提取样品，方法简便提取效率高。同时，这种方法的可行性经过HPLC的确证，色谱分析无干扰峰而且回收率稳定，重现性好。本文在这种前处理方法的基础上建立了化妆品中中甲醛和丙酮含量的高效液相色谱测定方法。该方法具有操作简单，灵敏度高，测定周期短等优点，明显提高了检测效率，适用于化妆品中中甲醛和丙酮含量的的检测。
致谢
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摘要 1
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Abstract 1
Key words 1
引言 1
1 材料与方法 2
1.1 材料 2
1.1.1 样品 2
1.1.2 试剂 2
1.1.3 主要仪器 2
1.2 方法 2
1.2.1 2,4-二硝基苯肼试剂的纯化 2
1.2.2 标准物质的制备 2
1.2.2.1 甲醛-DNPH的制备 2
1.2.2.2 丙酮-DNPH的制备 2
1.2.3 溶液的配制 3
1.2.3.1 甲醛衍生化反应准备液 3
1.2.3.2 丙酮衍生化反应准备液 3
1.2.3.3 2,4-二硝基苯肼溶液（500mg/L） 3
1.2.3.4 3.8mol/L高氯酸溶液 3
1.2.3.5 6mol/L盐酸溶液 3
1.2.3.6 6mol/L氢氧化钠溶液 3
1.2.3.7 磷酸盐缓冲溶液 3
1.2.4 化妆品样品前处理 3
1.2.5 样品测定 3
1.2.6 色谱条件 3
1.2.7 标准曲线的绘制 3
1.2.7.1 甲醛-DNPH标准曲线绘制 3
1.2.7.2 丙酮-DNPH标准曲线绘制 4
2 结果与分析 4
2.1 色谱条件选择 4
2.1.1 流动相选择 4
2.2 衍生萃取条件的选择 6
2.2.1 衍生剂用量的选 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: *351916072*
择 6
2.2.2 涡旋萃取时间选择 6
2.2.3 衍生化反应温度的选择 6
2.3 方法回收率和精密度 7
2.4 检出限 7
2.5 样品测定结果 7
3 讨论 8
4 结论 8
致谢 8
参考文献 9
化妆品中醛酮类化合物测定方法研究
引言
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