沙门氏菌生物菌膜及其特征性srnas
采用从食品级304不锈钢材质器械表面分离的肠炎沙门氏菌在以肉汁液（MTLB）和标准培养液（TSB）中模拟肉品加工与实验室培养，20℃培养三天得到生物菌膜和浮游菌体，提取成熟阶段生物菌膜和浮游菌体各样本的总RNA，然后利用RNA-seq技术和Illumina HiSeq2500测序平台对肠炎沙门氏菌的生物菌膜和浮游菌体各样本的总RNA进行转录组测序，从而鉴定分析其特征性sRNAs的差异基因表达，最后利用RT-qPCR技术验证分析特征性sRNAs的差异性表达。分析表明测序结果较为理想，并鉴定得到不同实验组间的差异表达基因，用RT-qPCR获得基因差异倍数与转录组结果趋势基本一致，基因表达倍数之间差异较小，结果可信度较高。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1材料与方法2
1.1材料 2
1.1.1主要试剂2
1.1.2主要仪器设备2
1.2方法 2
1.2.1肉汁培养基（MTLB）的制备2
1.2.2生物菌膜和浮游菌体的制备3
1.2.3总RNA提取3
1.2.4建库测序3
1.2.5特征性sRNAs以及mRNA的RTqPCR验证4
2结果与分析5
2.1TSB和MTLB中主要元素种类含量5
2.2总RNA样品质量5
2.2.1 RNA的纯度5
2.2.2总RNA样品测序产出数据质量评估情况5
2.3参考序列比对6
2.4 RNAseq相关性检查7
2.5 sRNA分析8
2.6 RTqPCR验证结果8
3讨论11
致谢12
参考文献12
沙门氏菌生物菌膜及其特征性sRNAs
引言
引言 沙门氏菌(Salmonella)是肠杆菌科一属，为革兰氏阴性、无芽孢和荚膜、有鞭毛的兼性厌氧菌，是一类在全球范围内广泛传播的重要人畜共患致病菌。沙门氏菌可通过食物链在人畜间传播，从而造成严重的公共卫生问题。在欧洲和美国，每 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: &351916072&
年由沙门氏菌引发的细菌性食物中毒数量居首[12];在我国，由沙门氏菌引起的食物中毒事件占细菌性食物中毒的70%~80%[3]。食源性致病菌可通过很多途径污染食品，由中国食源性疾病监测网的调查结果表明，最主要的污染途径是来自于食品加工设备等造成的交叉污染，达到了27%[4]。研究显示食源性致病菌可以粘附于食品及加工器械表面并生长，在菌体－接触面和菌体－菌体之间相互作用，通过菌体增殖、分泌胞外基质从而形成细菌聚集体，该聚集体被称为生物菌膜(Biofilm, BF)[5]。如果一些致病菌在食品制造及加工环境形成菌膜而难以清除，很容易造成食品污染。不管是致病菌还是非致病菌基本上都是以菌膜的形式定居于人体内的。生物菌膜的形成是在特定条件下一些微生物的特定的生长状态。形成菌膜后，菌体表现出一些不同于游离状态的生理特点，对不良环境的抗性增强。菌膜的形成及释放是一个动态可逆的过程，为了方便研究可将其形成过程分为以下五个阶段：表面接触和起始可逆吸附阶段、非可逆吸附阶段、发育阶段、成熟阶段及释放阶段[6]。
近年来，人们对非编码小RNA (small noncoding RNA, sRNA)的研究日益增多。细菌非编码小RNA (sRNA)是一类长度在几十至几百个核苷酸之间，与转录后的靶mRNA进行碱基配对，或者与调控蛋白结合的方式来调控靶基因表达的非编码RNA[7]。sRNAs在基因组中被转录但不编码功能蛋白质[8]，广泛存在于原核细菌的染色体中，只有少部分存在于噬菌体、质粒或转座子上。大多数sRNAs位于2个编码基因间的非编码区，少数sRNAs是从mRNA的5’或3’端的非转译区域剪切而来。在调控菌体响应外界环境（或宿主微环境）变化、细胞生长和新陈代谢、菌体毒力和其它生理特性过程中发挥着关键作用[9]。
作为肠道病原菌，沙门氏菌的毒力机制、微生物致病机制、基因表达和代谢途径等方面的研究已较为深入，近年来沙门氏菌已成为研究RNA介导调控的模式病原菌。目前在沙门氏菌的整个基因组范围内已能够成功鉴定sRNA的靶mRNA[10]。在标准培养基质下的沙门氏菌，其编码性mRNA对沙门氏菌生物菌膜的形成具有重要作用，细菌sRNA最普遍的机制是通过与靶mRNA配对来发挥功能，即与mRNA翻译区互补配对结合，从而影响mRNA的稳定性或者与mRNA的3’UTR结合来调控靶基因的表达和蛋白质的稳定性从而在转录水平对基因表达进行调控[11]。现已部分探明编码性mRNA可以通过CsgD系统、CsrABarA/SirA系统、RpoS系统和phoP/Q系统等通路[12]调节菌体的菌毛/鞭毛、外膜蛋白、移动性能、二级代谢、抗应激能力和胞外类脂分泌等方面，从而参与生物菌膜的形成调控。
借助已有的对沙门氏菌生物菌膜形成的机制研究以及细菌基因组测序技术，预测分析sRNA对沙门氏菌生物菌膜形成过程中转录水平上的调控作用。本实验运用多重序列比对技术识别鉴定sRNAs，并利用RTqPCR技术验证分析特征性sRNAs的差异性表达。
1 材料与方法
1．1 材料
1．1．1 主要试剂 氯化钠、乙醇、丙酮、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、氯仿、双缩脲试剂均为分析纯，购于上海化学试剂有限公司；缓冲蛋白胨水（BPW, Buffered peptone water）、胰蛋白胨大豆肉汤（TSB, Trypticace soy broth）均购于北京路桥有限责任公司、RNasefree水、PCR预混液Premix购于宝生物工程（大连）有限公司；琼脂糖购于北京索莱宝科技有限公司。
1．1．2 主要仪器设备 SG403A Sterile GARD生物安全柜，美国BAKER公司；DHGIII电热恒温鼓风干燥箱，上海新苗医疗器械制造有限公司；SPX250BZ型生化培养箱，上海博讯实业有限医疗设备厂；HVE50灭菌锅，日本HIRAYAMA公司；Microfuge@22R台式离心机，美国BECKMAN公司；TGL16G高速台式离心机，湖南湘仪离心机仪器有限公司；MLX206手掌型离心机，赛伯乐仪器有限公司；WH2微型旋涡混合仪，上海沪四分析仪器有限公司；Thermal Cycler普通PCR仪，美国Applied Biosystems公司；M2多功能酶标仪，美国Molecular Devices公司；FE20K型pH计，瑞士Mettler Toledo公司；PL202L天平，瑞士Mettler Toledo公司；MilliQ超纯水系统，美国Millipore公司；SIMF124制冰机，日本SANYO公司；食品级304不锈钢表面（50×20×1mm, 2B光洁面），东莞中意不锈钢材料有限公司；BagMixer400VW均质机，法国Interscience公司；平底透明96孔酶标板，美国Corning公司。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1材料与方法2
1.1材料 2
1.1.1主要试剂2
1.1.2主要仪器设备2
1.2方法 2
1.2.1肉汁培养基（MTLB）的制备2
1.2.2生物菌膜和浮游菌体的制备3
1.2.3总RNA提取3
1.2.4建库测序3
1.2.5特征性sRNAs以及mRNA的RTqPCR验证4
2结果与分析5
2.1TSB和MTLB中主要元素种类含量5
2.2总RNA样品质量5
2.2.1 RNA的纯度5
2.2.2总RNA样品测序产出数据质量评估情况5
2.3参考序列比对6
2.4 RNAseq相关性检查7
2.5 sRNA分析8
2.6 RTqPCR验证结果8
3讨论11
致谢12
参考文献12
沙门氏菌生物菌膜及其特征性sRNAs
引言
引言 沙门氏菌(Salmonella)是肠杆菌科一属，为革兰氏阴性、无芽孢和荚膜、有鞭毛的兼性厌氧菌，是一类在全球范围内广泛传播的重要人畜共患致病菌。沙门氏菌可通过食物链在人畜间传播，从而造成严重的公共卫生问题。在欧洲和美国，每 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: &351916072&
年由沙门氏菌引发的细菌性食物中毒数量居首[12];在我国，由沙门氏菌引起的食物中毒事件占细菌性食物中毒的70%~80%[3]。食源性致病菌可通过很多途径污染食品，由中国食源性疾病监测网的调查结果表明，最主要的污染途径是来自于食品加工设备等造成的交叉污染，达到了27%[4]。研究显示食源性致病菌可以粘附于食品及加工器械表面并生长，在菌体－接触面和菌体－菌体之间相互作用，通过菌体增殖、分泌胞外基质从而形成细菌聚集体，该聚集体被称为生物菌膜(Biofilm, BF)[5]。如果一些致病菌在食品制造及加工环境形成菌膜而难以清除，很容易造成食品污染。不管是致病菌还是非致病菌基本上都是以菌膜的形式定居于人体内的。生物菌膜的形成是在特定条件下一些微生物的特定的生长状态。形成菌膜后，菌体表现出一些不同于游离状态的生理特点，对不良环境的抗性增强。菌膜的形成及释放是一个动态可逆的过程，为了方便研究可将其形成过程分为以下五个阶段：表面接触和起始可逆吸附阶段、非可逆吸附阶段、发育阶段、成熟阶段及释放阶段[6]。
近年来，人们对非编码小RNA (small noncoding RNA, sRNA)的研究日益增多。细菌非编码小RNA (sRNA)是一类长度在几十至几百个核苷酸之间，与转录后的靶mRNA进行碱基配对，或者与调控蛋白结合的方式来调控靶基因表达的非编码RNA[7]。sRNAs在基因组中被转录但不编码功能蛋白质[8]，广泛存在于原核细菌的染色体中，只有少部分存在于噬菌体、质粒或转座子上。大多数sRNAs位于2个编码基因间的非编码区，少数sRNAs是从mRNA的5’或3’端的非转译区域剪切而来。在调控菌体响应外界环境（或宿主微环境）变化、细胞生长和新陈代谢、菌体毒力和其它生理特性过程中发挥着关键作用[9]。
作为肠道病原菌，沙门氏菌的毒力机制、微生物致病机制、基因表达和代谢途径等方面的研究已较为深入，近年来沙门氏菌已成为研究RNA介导调控的模式病原菌。目前在沙门氏菌的整个基因组范围内已能够成功鉴定sRNA的靶mRNA[10]。在标准培养基质下的沙门氏菌，其编码性mRNA对沙门氏菌生物菌膜的形成具有重要作用，细菌sRNA最普遍的机制是通过与靶mRNA配对来发挥功能，即与mRNA翻译区互补配对结合，从而影响mRNA的稳定性或者与mRNA的3’UTR结合来调控靶基因的表达和蛋白质的稳定性从而在转录水平对基因表达进行调控[11]。现已部分探明编码性mRNA可以通过CsgD系统、CsrABarA/SirA系统、RpoS系统和phoP/Q系统等通路[12]调节菌体的菌毛/鞭毛、外膜蛋白、移动性能、二级代谢、抗应激能力和胞外类脂分泌等方面，从而参与生物菌膜的形成调控。
借助已有的对沙门氏菌生物菌膜形成的机制研究以及细菌基因组测序技术，预测分析sRNA对沙门氏菌生物菌膜形成过程中转录水平上的调控作用。本实验运用多重序列比对技术识别鉴定sRNAs，并利用RTqPCR技术验证分析特征性sRNAs的差异性表达。
1 材料与方法
1．1 材料
1．1．1 主要试剂 氯化钠、乙醇、丙酮、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、氯仿、双缩脲试剂均为分析纯，购于上海化学试剂有限公司；缓冲蛋白胨水（BPW, Buffered peptone water）、胰蛋白胨大豆肉汤（TSB, Trypticace soy broth）均购于北京路桥有限责任公司、RNasefree水、PCR预混液Premix购于宝生物工程（大连）有限公司；琼脂糖购于北京索莱宝科技有限公司。
1．1．2 主要仪器设备 SG403A Sterile GARD生物安全柜，美国BAKER公司；DHGIII电热恒温鼓风干燥箱，上海新苗医疗器械制造有限公司；SPX250BZ型生化培养箱，上海博讯实业有限医疗设备厂；HVE50灭菌锅，日本HIRAYAMA公司；Microfuge@22R台式离心机，美国BECKMAN公司；TGL16G高速台式离心机，湖南湘仪离心机仪器有限公司；MLX206手掌型离心机，赛伯乐仪器有限公司；WH2微型旋涡混合仪，上海沪四分析仪器有限公司；Thermal Cycler普通PCR仪，美国Applied Biosystems公司；M2多功能酶标仪，美国Molecular Devices公司；FE20K型pH计，瑞士Mettler Toledo公司；PL202L天平，瑞士Mettler Toledo公司；MilliQ超纯水系统，美国Millipore公司；SIMF124制冰机，日本SANYO公司；食品级304不锈钢表面（50×20×1mm, 2B光洁面），东莞中意不锈钢材料有限公司；BagMixer400VW均质机，法国Interscience公司；平底透明96孔酶标板，美国Corning公司。
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