加州鲈鱼烂鳃病病原菌的分离鉴定及药敏性分析(附件)
本文主要是分离和鉴定鲈鱼的烂鳃病病原菌以及进行相应的药敏性分析，目的在于能够给加州鲈鱼烂鳃病病害防治提供依据。镜检后通过结合菌落形态观察并使用革兰氏染色法判断其菌种；生物分子鉴定，对其DNA进行PCR扩增，委托上海生工对其进行16S rDNA基因测序，测序结果在NCBI使用BLAST在数据库进行对比，采用MEGA 7软件做进化树进行分析，确定其最相似种；多种生理生化实验来判断其阴性或阳性；药敏实验，来确定烂鳃病的源来并且相关的抗生素作用下的活性，判断市面上抗生素的最优效果。最终得到此两株菌株为芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌，以及药敏性实验效果最优的为盐酸壮观霉素。关键词 烂鳃病，药敏分析，分离鉴定
目 录
1引言 1
1.1加州鲈鱼的简介 1
1.2加州鲈鱼的常见疾病 2
1.3病原菌的生物防治 4
1.4研究意义 6
1.5研究思路 7
2主要试剂和仪器 7
2.1试验材料 7
2.2主要试剂 7
2.3主要仪器 8
2.4溶液与培养基 9
3实验方法 10
3.1观察 10
3.2分离病原菌 10
3.3革兰氏染色 11
3.4分子生物学鉴定 11
3.5生理生化实验 13
3.6药敏实验 14
4结果与讨论 14
4.1病鱼观察 14
4.2革兰氏染色 15
4.3分子生物学鉴定 16
4.4生理生化实验 19
4.5药敏试验 21
结 论 25
致 谢 26
参考文献 27
1引言
1.1加州鲈鱼的简介
加州鲈鱼起源于美国加利福尼亚密西西比河系[1]，是一种肉质鲜美、抗病性强、生长快、捕捞容易、温度范围宽的珍贵食肉鱼类。通过推广，它已广泛分布在美国、加拿大和其他淡水水域，特别是在五大湖，资源丰富。目前，加州鲈鱼也已被引入到英国、法国、南非、巴西、菲律宾等国家。中国台湾省在20世纪70年代，到现在为止已经被育种几代。1983，深圳、惠阳、佛 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072#
山等地也引进了加州鲈鱼，并于1985成功地进行了人工养殖。加州鲈鱼可在池塘养殖，用于混养或单养，也可在清水鱼塘里繁育。由于它本身坚实的肉质，新鲜的味道，并在旺季新鲜上市，在餐厅的水族馆中作为新鲜的食物成为可能。它是一种高级鱼类，也很受欢迎。此外，加州鲈鱼可供游客垂钓或者捕抓，因此受到世界各地许多玩家的喜爱。这无疑对发展休闲渔业、吸引游客和增加经济收入非常有益。加州鲈鱼生长快，繁殖鱼苗可增长到0.5公斤的市场规格。一周大的鱼就会性成熟，可以进行繁殖。无论是池塘养殖还是混养池塘[2]，都能有效控制鱼塘中的加州鲈鱼过度繁殖。是一个值得推广的优良品种。加州鲈鱼主要分布在低浊度[3]水域和水生植物分布中，如湖泊、浅水区水库（13米水深）、沼泽地区溪流、河流滞流区、池塘等。经常藏匿在水下的岩石或树枝上，有栖息习性，活动范围相对较小。它喜欢生活在平静的水环境中，沙子或泥浆较少的水中，在中、下水层中是较为活跃的。性情比较温顺，不喜欢活动。加州鲈鱼的温度范围宽，可在136.4℃的水温下存活，在10℃以上的温度下开始进食，最适生长温度为2030℃，每升溶解氧的水质要求大于1.5毫克，耐缺氧能力强[4]。经试验证明，加州鲈鱼还可以适应盐度低于10或pH值在68之间的水体的淡水。加州鲈鱼是以食肉为主的食肉动物，捕食性较强，摄食量大，常单独觅食，喜欢吃小鱼虾。当水质良好，水温在25℃以上时，幼鱼可消耗总重量的50%，达到成年鱼的20%。食物的种类取决于鱼的大小。孵化一个月内的鱼苗主要吃轮虫和小甲壳动物。当饲料短缺时，往往会出现争夺食物的环境下，食物摄入需求非常大。食物摄入量在冬季和产卵期减少[5]。当水温过低时，池水太浑浊或水面环境较差时，经常停止进食。由于食用量大，生长迅速，人工养殖可提高鱼苗0.50.75公斤，符合市场规范。两年育种，重达1.5公斤左右。大约2.5公斤，3年。已知最大栽培个体长75厘米，重9.7公斤。在河流中捕获的最大个体长82.7厘米，重10.1公斤。超过1年的加州鲈鱼是成熟的。产卵发生在二月和七月之间，四月是产卵期。适宜的养殖水温为1826°C，最好为2024°C。体重1公斤的雌鱼产卵400000100000个卵。它们每次产卵和产卵2000到10000粒。通常，雌鱼和雌鱼难以区分。在繁殖季节，雌鱼有深色的颜色，圆形的胸鳍，腹部增大，身体相对较短和厚，以及红色和肿胀的生殖孔；雄鱼稍长，身体稍轻。鱼苗培养时间一般为57天。新孵化的鱼体近白色，半透明，总长度78毫米，游泳成群。在第三天，鱼苗开始摄取小球藻和轮虫，之后摄取浮游生物，如小簧管和桡足类[69]。在自然水域中，孵化后1个月内的鱼苗仍受到雄鱼的保护。虽然加州鲈鱼的人工养殖可以利用淡水、长水生植物（如金藻、黑叶藻类等）和自然产卵中的沙子和池塘，但产卵率低[10]，鱼苗大小不均匀，容易相互残杀。但育种需要的鱼类主要是通过人工繁殖获得的。
1.2加州鲈鱼的常见疾病
1.2.1烂鳃病
发病初期鳃部充血，轻度肿胀，在颧骨瓣前后的亮红色和黑色带之间的边界。鳃丝前端出现坏死、腐烂，粘液增多。在严重的情况下，前软骨的鳃丝前端暴露、折断，有些鱼有部分或完全贫血和失血的情况；通常，由于粘液和溃疡的增加，颧瓣的前部附着在池中的泥中。表皮部分表现为某些鱼皮也由于病原菌的感染而充血和发炎，中间部分被腐蚀成近似椭圆形或不规则的透明窗，俗称“开天窗”。病鱼因脏器损坏从而使得呼吸功能衰竭，最后导致死亡[11]。可在发病季节每半个月遍洒一次生石灰水，也可在鱼种进塘时，用2%2.5%的食盐水浸洗鱼种2030分钟，以杀死鱼体上的病原菌。并且在水体消毒的同时，内服抗生素，如氟哌酸、土霉素，连喂加入饲料中喂食；或选用鱼疾宁2型拌入饲料投喂，连续使用数日可达到最好的效果[12]。
1.2.2锚头鳋病
病原体是锚头鳋，它寄生在鱼的皮肤、鳍、眼、头等部位。症状为寄生于背鳍、腹鳍、尾鳍基部和体表的蠕虫[13]，部分蠕虫暴露于宿主体外肉眼可见，寄生部位常有出血现象，表现为小红斑、鱼体消瘦、食欲减退。夏季水温为2537℃时，寿命仅为1423天，只要切断锚头鳋的传播途径，就能很好地解决锚头鳋疾病。如有复发，可重复使用一次虫鳋净，将水中的锚头鳋全部杀死。虫鳋净有效的利用了锚头鳋具有蜕皮的习性，控制了未成年的锚头鳋的蜕皮发育这一关键控制点，这样就不能自由寄生到鱼体，从而获取营养成分，最终死亡，完美的解决了锚头鳋容易反复复发的问题[1418]。最终其脱落后再用碘净进行全面的消毒，从而达到预防细菌性疾病的目的。
目 录
1引言 1
1.1加州鲈鱼的简介 1
1.2加州鲈鱼的常见疾病 2
1.3病原菌的生物防治 4
1.4研究意义 6
1.5研究思路 7
2主要试剂和仪器 7
2.1试验材料 7
2.2主要试剂 7
2.3主要仪器 8
2.4溶液与培养基 9
3实验方法 10
3.1观察 10
3.2分离病原菌 10
3.3革兰氏染色 11
3.4分子生物学鉴定 11
3.5生理生化实验 13
3.6药敏实验 14
4结果与讨论 14
4.1病鱼观察 14
4.2革兰氏染色 15
4.3分子生物学鉴定 16
4.4生理生化实验 19
4.5药敏试验 21
结 论 25
致 谢 26
参考文献 27
1引言
1.1加州鲈鱼的简介
加州鲈鱼起源于美国加利福尼亚密西西比河系[1]，是一种肉质鲜美、抗病性强、生长快、捕捞容易、温度范围宽的珍贵食肉鱼类。通过推广，它已广泛分布在美国、加拿大和其他淡水水域，特别是在五大湖，资源丰富。目前，加州鲈鱼也已被引入到英国、法国、南非、巴西、菲律宾等国家。中国台湾省在20世纪70年代，到现在为止已经被育种几代。1983，深圳、惠阳、佛 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072#
山等地也引进了加州鲈鱼，并于1985成功地进行了人工养殖。加州鲈鱼可在池塘养殖，用于混养或单养，也可在清水鱼塘里繁育。由于它本身坚实的肉质，新鲜的味道，并在旺季新鲜上市，在餐厅的水族馆中作为新鲜的食物成为可能。它是一种高级鱼类，也很受欢迎。此外，加州鲈鱼可供游客垂钓或者捕抓，因此受到世界各地许多玩家的喜爱。这无疑对发展休闲渔业、吸引游客和增加经济收入非常有益。加州鲈鱼生长快，繁殖鱼苗可增长到0.5公斤的市场规格。一周大的鱼就会性成熟，可以进行繁殖。无论是池塘养殖还是混养池塘[2]，都能有效控制鱼塘中的加州鲈鱼过度繁殖。是一个值得推广的优良品种。加州鲈鱼主要分布在低浊度[3]水域和水生植物分布中，如湖泊、浅水区水库（13米水深）、沼泽地区溪流、河流滞流区、池塘等。经常藏匿在水下的岩石或树枝上，有栖息习性，活动范围相对较小。它喜欢生活在平静的水环境中，沙子或泥浆较少的水中，在中、下水层中是较为活跃的。性情比较温顺，不喜欢活动。加州鲈鱼的温度范围宽，可在136.4℃的水温下存活，在10℃以上的温度下开始进食，最适生长温度为2030℃，每升溶解氧的水质要求大于1.5毫克，耐缺氧能力强[4]。经试验证明，加州鲈鱼还可以适应盐度低于10或pH值在68之间的水体的淡水。加州鲈鱼是以食肉为主的食肉动物，捕食性较强，摄食量大，常单独觅食，喜欢吃小鱼虾。当水质良好，水温在25℃以上时，幼鱼可消耗总重量的50%，达到成年鱼的20%。食物的种类取决于鱼的大小。孵化一个月内的鱼苗主要吃轮虫和小甲壳动物。当饲料短缺时，往往会出现争夺食物的环境下，食物摄入需求非常大。食物摄入量在冬季和产卵期减少[5]。当水温过低时，池水太浑浊或水面环境较差时，经常停止进食。由于食用量大，生长迅速，人工养殖可提高鱼苗0.50.75公斤，符合市场规范。两年育种，重达1.5公斤左右。大约2.5公斤，3年。已知最大栽培个体长75厘米，重9.7公斤。在河流中捕获的最大个体长82.7厘米，重10.1公斤。超过1年的加州鲈鱼是成熟的。产卵发生在二月和七月之间，四月是产卵期。适宜的养殖水温为1826°C，最好为2024°C。体重1公斤的雌鱼产卵400000100000个卵。它们每次产卵和产卵2000到10000粒。通常，雌鱼和雌鱼难以区分。在繁殖季节，雌鱼有深色的颜色，圆形的胸鳍，腹部增大，身体相对较短和厚，以及红色和肿胀的生殖孔；雄鱼稍长，身体稍轻。鱼苗培养时间一般为57天。新孵化的鱼体近白色，半透明，总长度78毫米，游泳成群。在第三天，鱼苗开始摄取小球藻和轮虫，之后摄取浮游生物，如小簧管和桡足类[69]。在自然水域中，孵化后1个月内的鱼苗仍受到雄鱼的保护。虽然加州鲈鱼的人工养殖可以利用淡水、长水生植物（如金藻、黑叶藻类等）和自然产卵中的沙子和池塘，但产卵率低[10]，鱼苗大小不均匀，容易相互残杀。但育种需要的鱼类主要是通过人工繁殖获得的。
1.2加州鲈鱼的常见疾病
1.2.1烂鳃病
发病初期鳃部充血，轻度肿胀，在颧骨瓣前后的亮红色和黑色带之间的边界。鳃丝前端出现坏死、腐烂，粘液增多。在严重的情况下，前软骨的鳃丝前端暴露、折断，有些鱼有部分或完全贫血和失血的情况；通常，由于粘液和溃疡的增加，颧瓣的前部附着在池中的泥中。表皮部分表现为某些鱼皮也由于病原菌的感染而充血和发炎，中间部分被腐蚀成近似椭圆形或不规则的透明窗，俗称“开天窗”。病鱼因脏器损坏从而使得呼吸功能衰竭，最后导致死亡[11]。可在发病季节每半个月遍洒一次生石灰水，也可在鱼种进塘时，用2%2.5%的食盐水浸洗鱼种2030分钟，以杀死鱼体上的病原菌。并且在水体消毒的同时，内服抗生素，如氟哌酸、土霉素，连喂加入饲料中喂食；或选用鱼疾宁2型拌入饲料投喂，连续使用数日可达到最好的效果[12]。
1.2.2锚头鳋病
病原体是锚头鳋，它寄生在鱼的皮肤、鳍、眼、头等部位。症状为寄生于背鳍、腹鳍、尾鳍基部和体表的蠕虫[13]，部分蠕虫暴露于宿主体外肉眼可见，寄生部位常有出血现象，表现为小红斑、鱼体消瘦、食欲减退。夏季水温为2537℃时，寿命仅为1423天，只要切断锚头鳋的传播途径，就能很好地解决锚头鳋疾病。如有复发，可重复使用一次虫鳋净，将水中的锚头鳋全部杀死。虫鳋净有效的利用了锚头鳋具有蜕皮的习性，控制了未成年的锚头鳋的蜕皮发育这一关键控制点，这样就不能自由寄生到鱼体，从而获取营养成分，最终死亡，完美的解决了锚头鳋容易反复复发的问题[1418]。最终其脱落后再用碘净进行全面的消毒，从而达到预防细菌性疾病的目的。
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