牛肌肉组织中n糖组的研究
摘要：本研究旨在建立和优化以超高效液相色谱（UPLC）为核心、结合荧光标记的寡糖结构分析方法。研究内容包括：以牛肌肉组织为研究对象，采用两种不同方法对其进行处理后，采用N-糖肽酶F（PNGaseF）释放牛肉、牛心、牛肝和牛肾组织N-糖链，将酶解液用多孔石墨碳柱进行固相萃取，经纯化富集得到N-糖链后，进行荧光标记，然后利用超高压液相色谱分析糖链。通过研究，发现牛不同组织中的N-糖组存在结构和含量上的差异，而且通过两种实验方案的比较，建立起了一套完整的、简便的牛肌肉组织中糖蛋白上寡糖提取及分析的方法，为以后其他动物源中糖蛋白寡糖的分析提供参考。
目录
摘要 1
关键词 1
Abstract 1
Key words 1
1 材料与方法 2
1. 1 材料 2
1．1．1 样品 2
1．1．2 酶试剂 2
1．1．3 蛋白标准品 2
1．1．4 其它材料 2
1．1．5 实验常用试剂的配置 2
1．1．6 阳离子交换树脂预处理 2
1. 2 仪器 3
1. 3 色谱条件 3
1. 4 PNGase F活性验证 3
1. 5 牛肌肉组织中N糖组研究 3
1．5．1 糖蛋白样品的制备 3
1．5．2 胃蛋白酶消化 3
1．5．3 糖肽的富集 3
1．5．4 N糖链的释放 4
1．5．5 N糖链的纯化 4
1．5．6 糖链的荧光衍生 4
1．5．7 过UPLC分析糖链 4
2 结果与分析 5
2．1 PNGase F酶活性验证 5
2．2 牛肌肉组织中N糖组 5
2．3 GU值的计算 9
2．4 两种实验方案结果的比较 12
3 讨论 12
致谢 12
参考文献 13
图1.1 不加PNGase F处理的Fetuin 5
图1.2 加PNGase F处理的Fetuin
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: 3 5 1 9 1 6 0 7 2
5
图2.1 a、b两组牛心中的N寡糖链 6
图2.2 a、b两组牛肝中的N寡糖链 6
图2.3 a、b两组牛肉中的N寡糖链 7
图2.4 a、b两组牛肾中的N寡糖链 7
图2.5 牛心（A)、牛肝（B）、牛肾（C）、牛肉（D)中的N寡糖链（a组） 8
图2.6 牛肉中的N寡糖链（a组） 8
图2.7 牛心（A)、牛肝（B）、牛肾（C）、牛肉（D)中的N寡糖链（b组） 9
图2.8 牛肉中的N寡糖链（b组） 9
图3.1 Dextran在UPLC上的保留时间 10
图3.2 本实验室设计的GU值计算软件 10
表1 液相色谱洗脱程序 4
表2 牛心中N寡糖GU值 10
表3 牛肝中N寡糖GU值 11
表4 牛肉中N寡糖GU值 11
表5 牛肾中N寡糖GU值 11
牛肌肉组织中N糖组的研究
引言
蛋白质糖基化修饰是重要的翻译后修饰途径之一，广泛存在于古细菌、细菌以及真核生物的生命体中，尤其在真核生物中，大部分蛋白质都以糖蛋白的形式存在，据报导有超过50%的蛋白质都发生了糖基化修饰[14]。根据糖蛋白中糖基/糖链和蛋白质的连接方式，蛋白质糖基化主要分为4类：N连接糖基化、O连接糖基化、C甘露糖糖基化与糖基磷脂酰肌醇（GPI）锚区（Blom等，2004）[3]。其中N糖基化是一种与疾病密切相关的蛋白质翻译后修饰[5]。近几年，随着人们对糖类物质研究的不断深入，发现糖链作为生物信息分子参与了生物体几乎所有的生命过程，在细胞分化、发育、免疫、老化、癌变、信息传递等生命和疾病过程中起着识别、介导与调控作用[6,7]。因此，对糖链结构及其生物学作用的研究对揭示生命现象的本质具有重要意义。
糖蛋白是蛋白质和寡糖链的共价复合物，理论上讲，糖链有无数种结构形式[8,9]。然而，生物体内某种限制因素，使实际存在的糖链类型大减，分为N连接和O连接两类糖链：前者是糖链与蛋白AsnXXXSerPThr序列子（XXX为除脯氨酸以外的氨基酸）中Asn残基上的NH2相连；后者则是糖链与蛋白Ser或Thr残基上的OH相连。N连接和O连接糖蛋白主要定位于细胞膜表面，也可以以分泌型蛋白的形式存在[10]。
近些年来，随着现代分析技术的出现和发展，新技术的引入使得糖链的结构工作已经不再如以前那样令人生畏[11]。迄今为止，对糖链的分析主要包括糖蛋白的提取和富集、糖链的释放、标记、纯化及其结构鉴定[12]。由于糖链具有微不均一性的特点[13,14]，而且糖不是基因的直接编码产物，相同单糖组成的糖链其连接方式、糖苷键键型和连接位点都有可能不同，因此糖的分子结构远比蛋白质和核酸复杂得多，对糖链进行结构分析也远比对蛋白质和核酸进行分子结构分析要困难得多，那么建立一种有效的提取糖蛋白、分离分析糖链的方法就显得尤为重要。
相较于其它来源的样品，动物组织样品由于结构和成分复杂，要从其中提取糖蛋白并进行糖链的结构分析更为不易，需要找到并建立起一种具有广泛而稳定的实用性的方法，以利于开展关于动物源糖分子结构和功能的研究。本课题将以牛肌肉组织(心、肝、肉、肾）为原始样品，从中提取糖蛋白，以UPLC为核心技术，建立起一种动物源糖蛋白糖链提取及结构分析方法，为其它动物组织中（如小鼠）糖蛋白糖链的分析研究提供参考。
1 材料与方法
1. 1 材料
1．1．1 样品
牛组织（心、肝、肉、肾）购于南京淳化屠宰场
1．1．2 酶试剂
PNGase F(本实验室自主研制)，胃蛋白酶(美国SIGMA)
1．1．3 蛋白标准品
胎球蛋白Fetuin（纯度98.0%）
1．1．4 其它材料
所有实验用水均为超纯水，乙腈为色谱纯（德国Merck），其它所用试剂均为分析纯，多孔石墨碳柱（Supelclean? ENVICarb?固相萃取管, 3mL, 0.25g, SUPELCO, 美国SIGMA），葡聚糖凝胶树脂G25，葡聚糖（Dextran），阳离子交换树脂Dowex 50WX8 200400(H)
目录
摘要 1
关键词 1
Abstract 1
Key words 1
1 材料与方法 2
1. 1 材料 2
1．1．1 样品 2
1．1．2 酶试剂 2
1．1．3 蛋白标准品 2
1．1．4 其它材料 2
1．1．5 实验常用试剂的配置 2
1．1．6 阳离子交换树脂预处理 2
1. 2 仪器 3
1. 3 色谱条件 3
1. 4 PNGase F活性验证 3
1. 5 牛肌肉组织中N糖组研究 3
1．5．1 糖蛋白样品的制备 3
1．5．2 胃蛋白酶消化 3
1．5．3 糖肽的富集 3
1．5．4 N糖链的释放 4
1．5．5 N糖链的纯化 4
1．5．6 糖链的荧光衍生 4
1．5．7 过UPLC分析糖链 4
2 结果与分析 5
2．1 PNGase F酶活性验证 5
2．2 牛肌肉组织中N糖组 5
2．3 GU值的计算 9
2．4 两种实验方案结果的比较 12
3 讨论 12
致谢 12
参考文献 13
图1.1 不加PNGase F处理的Fetuin 5
图1.2 加PNGase F处理的Fetuin
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: 3 5 1 9 1 6 0 7 2
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图2.1 a、b两组牛心中的N寡糖链 6
图2.2 a、b两组牛肝中的N寡糖链 6
图2.3 a、b两组牛肉中的N寡糖链 7
图2.4 a、b两组牛肾中的N寡糖链 7
图2.5 牛心（A)、牛肝（B）、牛肾（C）、牛肉（D)中的N寡糖链（a组） 8
图2.6 牛肉中的N寡糖链（a组） 8
图2.7 牛心（A)、牛肝（B）、牛肾（C）、牛肉（D)中的N寡糖链（b组） 9
图2.8 牛肉中的N寡糖链（b组） 9
图3.1 Dextran在UPLC上的保留时间 10
图3.2 本实验室设计的GU值计算软件 10
表1 液相色谱洗脱程序 4
表2 牛心中N寡糖GU值 10
表3 牛肝中N寡糖GU值 11
表4 牛肉中N寡糖GU值 11
表5 牛肾中N寡糖GU值 11
牛肌肉组织中N糖组的研究
引言
蛋白质糖基化修饰是重要的翻译后修饰途径之一，广泛存在于古细菌、细菌以及真核生物的生命体中，尤其在真核生物中，大部分蛋白质都以糖蛋白的形式存在，据报导有超过50%的蛋白质都发生了糖基化修饰[14]。根据糖蛋白中糖基/糖链和蛋白质的连接方式，蛋白质糖基化主要分为4类：N连接糖基化、O连接糖基化、C甘露糖糖基化与糖基磷脂酰肌醇（GPI）锚区（Blom等，2004）[3]。其中N糖基化是一种与疾病密切相关的蛋白质翻译后修饰[5]。近几年，随着人们对糖类物质研究的不断深入，发现糖链作为生物信息分子参与了生物体几乎所有的生命过程，在细胞分化、发育、免疫、老化、癌变、信息传递等生命和疾病过程中起着识别、介导与调控作用[6,7]。因此，对糖链结构及其生物学作用的研究对揭示生命现象的本质具有重要意义。
糖蛋白是蛋白质和寡糖链的共价复合物，理论上讲，糖链有无数种结构形式[8,9]。然而，生物体内某种限制因素，使实际存在的糖链类型大减，分为N连接和O连接两类糖链：前者是糖链与蛋白AsnXXXSerPThr序列子（XXX为除脯氨酸以外的氨基酸）中Asn残基上的NH2相连；后者则是糖链与蛋白Ser或Thr残基上的OH相连。N连接和O连接糖蛋白主要定位于细胞膜表面，也可以以分泌型蛋白的形式存在[10]。
近些年来，随着现代分析技术的出现和发展，新技术的引入使得糖链的结构工作已经不再如以前那样令人生畏[11]。迄今为止，对糖链的分析主要包括糖蛋白的提取和富集、糖链的释放、标记、纯化及其结构鉴定[12]。由于糖链具有微不均一性的特点[13,14]，而且糖不是基因的直接编码产物，相同单糖组成的糖链其连接方式、糖苷键键型和连接位点都有可能不同，因此糖的分子结构远比蛋白质和核酸复杂得多，对糖链进行结构分析也远比对蛋白质和核酸进行分子结构分析要困难得多，那么建立一种有效的提取糖蛋白、分离分析糖链的方法就显得尤为重要。
相较于其它来源的样品，动物组织样品由于结构和成分复杂，要从其中提取糖蛋白并进行糖链的结构分析更为不易，需要找到并建立起一种具有广泛而稳定的实用性的方法，以利于开展关于动物源糖分子结构和功能的研究。本课题将以牛肌肉组织(心、肝、肉、肾）为原始样品，从中提取糖蛋白，以UPLC为核心技术，建立起一种动物源糖蛋白糖链提取及结构分析方法，为其它动物组织中（如小鼠）糖蛋白糖链的分析研究提供参考。
1 材料与方法
1. 1 材料
1．1．1 样品
牛组织（心、肝、肉、肾）购于南京淳化屠宰场
1．1．2 酶试剂
PNGase F(本实验室自主研制)，胃蛋白酶(美国SIGMA)
1．1．3 蛋白标准品
胎球蛋白Fetuin（纯度98.0%）
1．1．4 其它材料
所有实验用水均为超纯水，乙腈为色谱纯（德国Merck），其它所用试剂均为分析纯，多孔石墨碳柱（Supelclean? ENVICarb?固相萃取管, 3mL, 0.25g, SUPELCO, 美国SIGMA），葡聚糖凝胶树脂G25，葡聚糖（Dextran），阳离子交换树脂Dowex 50WX8 200400(H)
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