猪肌肉组织中糖蛋白n链糖组结构研究
摘要：糖生物学是生命科学领域的新兴热点学科，与食品科学有着紧密的联系，其中糖链的结构解析是糖生物学研究的基础和前提。本论文以猪肌肉组织（包括猪肉、肝、肾组织）为研究对象，探索从中提取分析糖蛋白N-糖链的方法，并在此基础上对猪肌肉组织的N-链糖组进行详细的结构解析。本文用常规方法首先对猪肌肉组织进行前处理，去脂，接下来进行胃蛋白酶消化，阳离子交换柱和G25柱富集糖肽，利用PNGase F酶释放猪肌肉组织的N-糖链，活性炭固相萃取柱纯化糖链，2-氨基苯甲酰胺（2-Amino Benzamide , 2-AB）荧光标记糖链，最后利用超高压液相色谱与外切糖苷酶技术简单的对猪肾N-糖链进行结构分析。完成结构分析后发现常规方法对于样品有所损失，于是建立新的提取方法。新方法主要是利用TCA沉淀蛋白后直接提取糖链，使提取效率更高，并首次得出了猪肌肉组织糖蛋白N-链糖组的主要结构，为后续糖链生物学功能研究和来源于其他动物组织的糖蛋白糖链的提取和分析提供重要参考。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1 材料与方法2
1.1 材料 2
1.1.1 试剂与实验材料 2 1.1.1 外切糖苷酶试剂 2 1.1.1 其他材料 2 1.1.1 仪器2
1.2 标准蛋白N糖链提取2
1.2.1 标准蛋白溶液配置2
1.2.2 标准蛋白糖链的释放2
1.2.3 标准蛋白糖链的纯化2
1.2.4 标准蛋白糖链的荧光衍生2
1.3 胃蛋白酶提取糖蛋白方法2
1.3.1 样品前处理2
1.3.2 去脂3
1.3.3 胃蛋白酶消化3
1.3.4 糖肽的富集3
1.3.5 糖链的释放3
1.3.6 糖链的纯化3
1.3.7 糖链的荧光衍生3
1.4 去脂TCA提取糖蛋白方法3
1.4.1 样品前处理3
1.4.2 去脂3
1.4.3 糖蛋白提取3
1.4.4
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: ￥351916072￥
糖链的释放3
1.4.5 糖链的纯化3
1.4.6 糖链的荧光化衍生4
1.5 不去脂TCA提取糖蛋白方法4
1.5.1 样品前处理4
1.5.2 糖蛋白提取4
1.5.3 糖链的释放4
1.5.4 糖链的纯化4
1.5.5 糖链的荧光化衍生4
2 超高压液相色谱条件4
3 外切糖苷酶处理 4
4 结果与讨论 5
4.1 自制PNGase F酶活性验证5
4.2 自制酶与商品化酶的比较6
4.3 N糖链的释放出7
4.4 糖链的荧光化衍生7
4.5 N糖链的提取方法7
4.6 猪肾胃蛋白酶法N寡糖链结构分析10
致谢15
参考文献15
图1 fetuin标准蛋白N糖链UHPLC图谱5
图2 lactoferrin标准蛋白N糖链UHPLC图谱6
图3 使用（a）自制PNGase F酶(b)与商品PNGase F酶释放乳铁蛋白N链寡糖的UHPLC
图谱6
图4 胃蛋白酶法提取猪肝N糖链UHPLC图谱7图5 胃蛋白酶法提取猪肉N糖链UHPLC图谱8
图6 胃蛋白酶法提取猪肾N糖链UHPLC图谱8
图7 不去脂TCA提取法猪肝N糖链UHPLC图谱8图8 不去脂TCA提取法猪肉N糖链UHPLC图谱9
图9 不去脂TCA提取法猪肾N糖链UHPLC图谱9
图10 去脂TCA提取法猪肝N糖链UHPLC图谱9
图11 去脂TCA提取法猪肉N糖链UHPLC图谱10
图12 去脂TCA提取法猪肾N糖链UHPLC图谱10
图13 糖图标及外切糖苷酶分析糖链结构原理11
图14 外切糖苷酶处理lactoferrin标准蛋白12图15 外切糖苷酶处理猪肾N糖链12
图16 猪肾N糖链结构分析13
表1 液相色谱洗脱程序4
表2 外切糖苷酶消化5
表3 单糖经酶切后的偏移值11
表4 猪肾的寡糖结构13
表5 猪肾N糖链结构分析14
猪肌肉组织的N糖链糖组结构研究
引言
糖基化是蛋白质翻译后修饰最普遍且复杂的形式之一，广泛存在于古细菌、细菌以及真核生物的生命体中，尤其在真核生物中。 在真核生物细胞中，大约超过 50%的蛋白质发生了糖基化。蛋白质糖基化主要分为 N糖基化和 O糖基化 2 种类型[],其中作用更重要研究更深入的是N糖基化类型糖蛋白上的糖链具有极其复杂的结构和微观不均一性，在生物的生命活动中发挥着多样化的功能。例如，N糖基化在蛋白质折叠、细胞内物质运输、蛋白质降解、细胞间信号转导及细胞增殖等生命过程中具有重要作用。很多疾病与体内蛋白质的糖基化异常有关，已有报道糖基化异常与肿瘤的发生与发展有关。以糖链结构研究为重要内容的糖组学被认为是继基因组学和蛋白质学之后，生命科学研究的又一热点和前沿[]。
糖组学是研究糖链组成及其功能的一门新学科，近年来备受关注。近几年，随着人们对糖类物质研究的不断深入，发现糖链作为生物信息分子参与了生物体几乎所有的生命过程，特别是在细胞分化、发育、免疫、老化、癌变、信息传递等生命和疾病过程中起着特异性的识别、介导与调控作用[]。糖组学的研究与基因组学类似，并且糖组学是与所有生物领域密切相关的学科。然而由于糖链结构的复杂性，相比于蛋白质的广泛研究，糖链的研究明显滞后。目前阶段还不能在完整糖蛋白的水平上对糖链的详细结构信息进行研究，而需先从多肽骨架上释放寡糖链，再进一步研究糖链结构与功能的关系[]。
对糖链的分析主要包括糖蛋白的提取和富集、糖链的释放、标记、纯化及其结构鉴定[]。由于糖链微不均一性的特点[]，使得糖链的获取成为成功分析糖链结构的关键。迄今为止，糖链的研究主要应用于医学领域，比如作为肝癌等疾病的诊断标志物，在其它领域如动物医学和食品科学等领域的研究较少。因此，本文以猪肉、猪肝和猪肾组织为研究对象，采用不同的方法进行糖蛋白的提取与富集。利用N糖肽酶F（PNGase F）释放糖链，活性炭固相萃取柱纯化糖链，2氨基苯甲酰胺（2Amino Benzamide ,2AB）荧光标记糖链，利用超高压液相色谱和外切糖苷酶分析糖链结构。建立一种适合猪肉组织N糖链提取的方法，分析得到N链糖组的详细结构，为N糖链结构提取与研究提供参考。
1 材料与方法
1．1 材料
1．1．1 试剂与实验材料 猪肉、猪肾、猪肝材料购自南京市苏果超市；2氨基苯甲酰胺（2AB）购自天津希恩思生化科技有限公司；其他化学试剂都为化学分析纯。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1 材料与方法2
1.1 材料 2
1.1.1 试剂与实验材料 2 1.1.1 外切糖苷酶试剂 2 1.1.1 其他材料 2 1.1.1 仪器2
1.2 标准蛋白N糖链提取2
1.2.1 标准蛋白溶液配置2
1.2.2 标准蛋白糖链的释放2
1.2.3 标准蛋白糖链的纯化2
1.2.4 标准蛋白糖链的荧光衍生2
1.3 胃蛋白酶提取糖蛋白方法2
1.3.1 样品前处理2
1.3.2 去脂3
1.3.3 胃蛋白酶消化3
1.3.4 糖肽的富集3
1.3.5 糖链的释放3
1.3.6 糖链的纯化3
1.3.7 糖链的荧光衍生3
1.4 去脂TCA提取糖蛋白方法3
1.4.1 样品前处理3
1.4.2 去脂3
1.4.3 糖蛋白提取3
1.4.4
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: ￥351916072￥
糖链的释放3
1.4.5 糖链的纯化3
1.4.6 糖链的荧光化衍生4
1.5 不去脂TCA提取糖蛋白方法4
1.5.1 样品前处理4
1.5.2 糖蛋白提取4
1.5.3 糖链的释放4
1.5.4 糖链的纯化4
1.5.5 糖链的荧光化衍生4
2 超高压液相色谱条件4
3 外切糖苷酶处理 4
4 结果与讨论 5
4.1 自制PNGase F酶活性验证5
4.2 自制酶与商品化酶的比较6
4.3 N糖链的释放出7
4.4 糖链的荧光化衍生7
4.5 N糖链的提取方法7
4.6 猪肾胃蛋白酶法N寡糖链结构分析10
致谢15
参考文献15
图1 fetuin标准蛋白N糖链UHPLC图谱5
图2 lactoferrin标准蛋白N糖链UHPLC图谱6
图3 使用（a）自制PNGase F酶(b)与商品PNGase F酶释放乳铁蛋白N链寡糖的UHPLC
图谱6
图4 胃蛋白酶法提取猪肝N糖链UHPLC图谱7图5 胃蛋白酶法提取猪肉N糖链UHPLC图谱8
图6 胃蛋白酶法提取猪肾N糖链UHPLC图谱8
图7 不去脂TCA提取法猪肝N糖链UHPLC图谱8图8 不去脂TCA提取法猪肉N糖链UHPLC图谱9
图9 不去脂TCA提取法猪肾N糖链UHPLC图谱9
图10 去脂TCA提取法猪肝N糖链UHPLC图谱9
图11 去脂TCA提取法猪肉N糖链UHPLC图谱10
图12 去脂TCA提取法猪肾N糖链UHPLC图谱10
图13 糖图标及外切糖苷酶分析糖链结构原理11
图14 外切糖苷酶处理lactoferrin标准蛋白12图15 外切糖苷酶处理猪肾N糖链12
图16 猪肾N糖链结构分析13
表1 液相色谱洗脱程序4
表2 外切糖苷酶消化5
表3 单糖经酶切后的偏移值11
表4 猪肾的寡糖结构13
表5 猪肾N糖链结构分析14
猪肌肉组织的N糖链糖组结构研究
引言
糖基化是蛋白质翻译后修饰最普遍且复杂的形式之一，广泛存在于古细菌、细菌以及真核生物的生命体中，尤其在真核生物中。 在真核生物细胞中，大约超过 50%的蛋白质发生了糖基化。蛋白质糖基化主要分为 N糖基化和 O糖基化 2 种类型[],其中作用更重要研究更深入的是N糖基化类型糖蛋白上的糖链具有极其复杂的结构和微观不均一性，在生物的生命活动中发挥着多样化的功能。例如，N糖基化在蛋白质折叠、细胞内物质运输、蛋白质降解、细胞间信号转导及细胞增殖等生命过程中具有重要作用。很多疾病与体内蛋白质的糖基化异常有关，已有报道糖基化异常与肿瘤的发生与发展有关。以糖链结构研究为重要内容的糖组学被认为是继基因组学和蛋白质学之后，生命科学研究的又一热点和前沿[]。
糖组学是研究糖链组成及其功能的一门新学科，近年来备受关注。近几年，随着人们对糖类物质研究的不断深入，发现糖链作为生物信息分子参与了生物体几乎所有的生命过程，特别是在细胞分化、发育、免疫、老化、癌变、信息传递等生命和疾病过程中起着特异性的识别、介导与调控作用[]。糖组学的研究与基因组学类似，并且糖组学是与所有生物领域密切相关的学科。然而由于糖链结构的复杂性，相比于蛋白质的广泛研究，糖链的研究明显滞后。目前阶段还不能在完整糖蛋白的水平上对糖链的详细结构信息进行研究，而需先从多肽骨架上释放寡糖链，再进一步研究糖链结构与功能的关系[]。
对糖链的分析主要包括糖蛋白的提取和富集、糖链的释放、标记、纯化及其结构鉴定[]。由于糖链微不均一性的特点[]，使得糖链的获取成为成功分析糖链结构的关键。迄今为止，糖链的研究主要应用于医学领域，比如作为肝癌等疾病的诊断标志物，在其它领域如动物医学和食品科学等领域的研究较少。因此，本文以猪肉、猪肝和猪肾组织为研究对象，采用不同的方法进行糖蛋白的提取与富集。利用N糖肽酶F（PNGase F）释放糖链，活性炭固相萃取柱纯化糖链，2氨基苯甲酰胺（2Amino Benzamide ,2AB）荧光标记糖链，利用超高压液相色谱和外切糖苷酶分析糖链结构。建立一种适合猪肉组织N糖链提取的方法，分析得到N链糖组的详细结构，为N糖链结构提取与研究提供参考。
1 材料与方法
1．1 材料
1．1．1 试剂与实验材料 猪肉、猪肾、猪肝材料购自南京市苏果超市；2氨基苯甲酰胺（2AB）购自天津希恩思生化科技有限公司；其他化学试剂都为化学分析纯。
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