枯草芽孢杆菌脂肪酶酶学特性及动力学研究【字数：9588】
枯草芽孢杆菌是酶制剂生产中应用较广泛、产率较高的菌种之一，其研究伴随着很高的学术意义和产业化价值。本文研究了枯草芽孢杆菌脂肪酶的酶学性质和其酶学动力学。将实验室提供的枯草芽孢杆菌发酵培养，并将其培养液离心处理得到本实验所需的酶液，分别以单因素实验的方法研究了温度、pH、金属离子对其酶活性产生的不同的影响，通过双倒数曲线法作图并获得该酶的米氏常数Km。通过对实验结果的分析，枯草芽孢杆菌脂肪酶的最适反应温度是40℃，在25~40℃能保持比较稳定的酶活性，最适反应pH在6.7左右，在pH 6.2~7.7内有较良好的酸碱稳定性，Fe2+对其反应有较强烈的抑制作用，而 Ba2 +、Ca2 + 对反应有强烈的激活作用。草芽孢杆菌在最适条件下的动力学常数Km为8.4mmol/L，Vmax为0.3mmol/min。希望该实验的结果能够为从事此领域研究的人员提供参考。
Key words: bacillus subtilis; lipase; enzymatic characteristics; enzymatic kinetics 目录
1文献综述 1
1.1枯草芽孢杆菌概述 2
1.2脂肪酶概述 3
1.3本实验的目的和意义 4
2材料与方法 5
2.1试验材料 5
2.2仪器设备 5
2.3试验方法 6
2.3.1实验步骤 6
2.3.2单因素实验 7
3结果与分析 10
3.1温度对脂肪酶活力的影响 10
3.2枯草芽孢杆菌脂肪酶的热稳定性 12
3.3脂肪酶作用的最适pH 12
3.4 pH对脂肪酶稳定性的影响 13
3.5金属离子对脂肪酶活力的影响 13
3.6脂肪酶动力学常数 14
3.7小结 15
参考文献 16
致谢 18 1文献综述
1.1枯草芽孢杆菌概述
益生菌类群长期以来是人们研究的重点菌群，而枯草芽孢杆菌更因为其优异的环境友好性以及稳定的高产性而被重点关注。枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）是一种嗜温、好氧、产芽孢的杆状细菌，在自 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: *351916072*
然界中广泛存在，可利用蛋白质、多种糖、淀粉、脂肪等大分子物质。枯草芽孢杆菌的安全性高，不污染环境，在食品工业领域被广泛应用，其可以分泌出抗菌素和酶，具有产生多种具有抗菌活性的生物活性物质的能力，这些物质在不影响环境和人体健康的前提下，对宿主植物代谢的各种生理特性生产等方面的影响[1]。在蛋白酶、淀粉酶的生产领域这种菌有重要的应用。研究发现其分泌功能和生产能力很强，加之发酵培养基要求较低，长期以来一直被用作微生物生产酶、维生素和功能性糖的细胞工厂[2]；芽孢杆菌能够产生具有抗性的内生孢子，因此即使在不利的条件下，也能在寄主植物中维持它们触发防御反应的能力，这使得它能够很容易地形成和储存以杆菌为基础的生物产品，并作为一种有效的生物活性成分而起到抗病毒作用，同时还可以有效的改善动物肠道功能、对植物的生长发育起到一定调节作用，在畜牧业、酶制剂产业中都有不同程度的应用[3]。
这种杆菌为一种常见的革兰氏阳性菌，其细胞壁较厚，无毒害，枯草杆菌因其普遍被认为是安全的状态而被广泛应用于营养物质生产中。芽孢杆菌的有益作用可归因于合成了广泛的生物活性化合物（抗生素、铁素体、脂肽、酶、1氨基环丙烷1羧酸酯脱氨酶和胞外多糖）。作为合成生物学研究中最早使用的物种之一，因此在很多方面都有应用，并且不断的发现新的价值。例如，枯草芽孢杆菌在发酵中药领域也表现出一定应用价值：其分泌的纤维素酶可促使中药的有效成分释放，提高药效、增强其营养价值[4]；芽孢杆菌还具有调节植物激素生物合成途径，调节植物乙烯水平，影响挥发性有机化合物的释放和寄主植物系统抗性/耐受性的启动等功能；枯草芽孢杆菌都缺乏免疫原性脂多糖，使得它们比大肠杆菌和其他革兰氏阴性菌更好地用于表达健康相关产品，如抗微生物递送或口服疫苗[5] 。研究发现其可对植物病原起到抑制作用，同时还可激发植物的免疫机制，从而提高抗病性能。比如其可以对病原菌产生抑制作用，同时也能够促进马铃薯生长，提高马铃薯自身抗性，有效防治马铃薯黑痣病[6]。由于枯草芽孢杆菌对黑腐皮菌具有较好的抑制作用，目前已作为黑腐皮菌的生防菌目前已成为此领域的研究重点[7]；可通过其合成很多种维生素，而对生物的免疫能力起到调节作用，其适用性强，在土壤及腐败的有机物中都有广泛的分布，会明显的影响到土壤状况。其代谢过程中分泌的枯草菌素、多粘菌素等活性物质，可以起到良好的抗病毒作用，抑制其生长。这种菌还可以造成低氧环境，而促进有益厌氧菌生长，对致病菌起到抑制作用[8]。
目前大量的研究表明枯草芽孢杆菌是种应用广泛的益生菌，芽孢杆菌菌株对各种植物物种的保护作用都有很好的文献记载。对人体及动植物无害、促进作物生长、土壤提质和作物微环境改良、控制土传病害及农业耕地污染治理等方面具有重大的作用。并且在动物饲料、水产养殖业及植物病害防治等实际广泛应用中展现了优良的特性，枯草芽孢杆菌作为益生菌在微生物益生制剂中的应用也已展现出巨大的发展前景。目前对于枯草芽孢杆菌理论研究与实际应用都较为成熟，但在研究在取得成绩的同时也发现枯草芽孢杆菌应用中存在的一些缺点，比如菌剂产品的有效期短、作用速度缓慢、因具有特异性而作用对象较为单一、在应用过程中容易受到干扰[9] 。
1.2脂肪酶概述
脂肪酶属于中有多种催化作用的酶，其可促进三脂酰甘油水解形成脂肪酸，还可以对其逆反应酯化反应也起到催化作用，其适应能力强，在动植物和微生物中都有一定的分布。脂肪酶是一种糖蛋白，其中甘露糖的占比较高，整个分子可划分为亲水和疏水单元；其分子量存在较大的变化性，来源不同则对应氨基酸组成数目也存在明显差异。根据此方面的研究结果表明，这种酶的相对分子质量为16～200kD[10] 。各种微生物的脂肪酶的结构并表现出一定类似性，都存在α/β水解酶折叠，且对应的活性中心都是三联体结构，主要包括丝氨酸、组氨酸等[11]。对比分析结果表明，不同脂肪酶的相对分子质量、热稳定性、pH稳定性等指标存在明显差异性，同时相应的等电点等也各有不同。不过一般情况下其最适作用温度区间都为38~45℃。脂肪酶的生产方法有很多，可总体上划分为三类，也就是生物以发酵法，化学法合成、从动植物器官提取法，对比分析可知在具体应用领域，化学合成法、提取法的操作很复杂，存在明显的局限。而微生物发酵法的优势表现为，微生物资源多，方便操作，易发生遗传变异，适用范围广，底物专一性，因而可很好的满足工业生产要求，同时产品纯度高。因而这种方法的应用比例在不断提高，并成为工业脂肪酶主要的来源。微生物中细菌、真菌中的这种酶含量高，微生物脂肪酶的底物特异性高，可以很好的满足工业生产要求，在生产高纯酶制剂方面广泛应用。
Key words: bacillus subtilis; lipase; enzymatic characteristics; enzymatic kinetics 目录
1文献综述 1
1.1枯草芽孢杆菌概述 2
1.2脂肪酶概述 3
1.3本实验的目的和意义 4
2材料与方法 5
2.1试验材料 5
2.2仪器设备 5
2.3试验方法 6
2.3.1实验步骤 6
2.3.2单因素实验 7
3结果与分析 10
3.1温度对脂肪酶活力的影响 10
3.2枯草芽孢杆菌脂肪酶的热稳定性 12
3.3脂肪酶作用的最适pH 12
3.4 pH对脂肪酶稳定性的影响 13
3.5金属离子对脂肪酶活力的影响 13
3.6脂肪酶动力学常数 14
3.7小结 15
参考文献 16
致谢 18 1文献综述
1.1枯草芽孢杆菌概述
益生菌类群长期以来是人们研究的重点菌群，而枯草芽孢杆菌更因为其优异的环境友好性以及稳定的高产性而被重点关注。枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）是一种嗜温、好氧、产芽孢的杆状细菌，在自 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: *351916072*
然界中广泛存在，可利用蛋白质、多种糖、淀粉、脂肪等大分子物质。枯草芽孢杆菌的安全性高，不污染环境，在食品工业领域被广泛应用，其可以分泌出抗菌素和酶，具有产生多种具有抗菌活性的生物活性物质的能力，这些物质在不影响环境和人体健康的前提下，对宿主植物代谢的各种生理特性生产等方面的影响[1]。在蛋白酶、淀粉酶的生产领域这种菌有重要的应用。研究发现其分泌功能和生产能力很强，加之发酵培养基要求较低，长期以来一直被用作微生物生产酶、维生素和功能性糖的细胞工厂[2]；芽孢杆菌能够产生具有抗性的内生孢子，因此即使在不利的条件下，也能在寄主植物中维持它们触发防御反应的能力，这使得它能够很容易地形成和储存以杆菌为基础的生物产品，并作为一种有效的生物活性成分而起到抗病毒作用，同时还可以有效的改善动物肠道功能、对植物的生长发育起到一定调节作用，在畜牧业、酶制剂产业中都有不同程度的应用[3]。
这种杆菌为一种常见的革兰氏阳性菌，其细胞壁较厚，无毒害，枯草杆菌因其普遍被认为是安全的状态而被广泛应用于营养物质生产中。芽孢杆菌的有益作用可归因于合成了广泛的生物活性化合物（抗生素、铁素体、脂肽、酶、1氨基环丙烷1羧酸酯脱氨酶和胞外多糖）。作为合成生物学研究中最早使用的物种之一，因此在很多方面都有应用，并且不断的发现新的价值。例如，枯草芽孢杆菌在发酵中药领域也表现出一定应用价值：其分泌的纤维素酶可促使中药的有效成分释放，提高药效、增强其营养价值[4]；芽孢杆菌还具有调节植物激素生物合成途径，调节植物乙烯水平，影响挥发性有机化合物的释放和寄主植物系统抗性/耐受性的启动等功能；枯草芽孢杆菌都缺乏免疫原性脂多糖，使得它们比大肠杆菌和其他革兰氏阴性菌更好地用于表达健康相关产品，如抗微生物递送或口服疫苗[5] 。研究发现其可对植物病原起到抑制作用，同时还可激发植物的免疫机制，从而提高抗病性能。比如其可以对病原菌产生抑制作用，同时也能够促进马铃薯生长，提高马铃薯自身抗性，有效防治马铃薯黑痣病[6]。由于枯草芽孢杆菌对黑腐皮菌具有较好的抑制作用，目前已作为黑腐皮菌的生防菌目前已成为此领域的研究重点[7]；可通过其合成很多种维生素，而对生物的免疫能力起到调节作用，其适用性强，在土壤及腐败的有机物中都有广泛的分布，会明显的影响到土壤状况。其代谢过程中分泌的枯草菌素、多粘菌素等活性物质，可以起到良好的抗病毒作用，抑制其生长。这种菌还可以造成低氧环境，而促进有益厌氧菌生长，对致病菌起到抑制作用[8]。
目前大量的研究表明枯草芽孢杆菌是种应用广泛的益生菌，芽孢杆菌菌株对各种植物物种的保护作用都有很好的文献记载。对人体及动植物无害、促进作物生长、土壤提质和作物微环境改良、控制土传病害及农业耕地污染治理等方面具有重大的作用。并且在动物饲料、水产养殖业及植物病害防治等实际广泛应用中展现了优良的特性，枯草芽孢杆菌作为益生菌在微生物益生制剂中的应用也已展现出巨大的发展前景。目前对于枯草芽孢杆菌理论研究与实际应用都较为成熟，但在研究在取得成绩的同时也发现枯草芽孢杆菌应用中存在的一些缺点，比如菌剂产品的有效期短、作用速度缓慢、因具有特异性而作用对象较为单一、在应用过程中容易受到干扰[9] 。
1.2脂肪酶概述
脂肪酶属于中有多种催化作用的酶，其可促进三脂酰甘油水解形成脂肪酸，还可以对其逆反应酯化反应也起到催化作用，其适应能力强，在动植物和微生物中都有一定的分布。脂肪酶是一种糖蛋白，其中甘露糖的占比较高，整个分子可划分为亲水和疏水单元；其分子量存在较大的变化性，来源不同则对应氨基酸组成数目也存在明显差异。根据此方面的研究结果表明，这种酶的相对分子质量为16～200kD[10] 。各种微生物的脂肪酶的结构并表现出一定类似性，都存在α/β水解酶折叠，且对应的活性中心都是三联体结构，主要包括丝氨酸、组氨酸等[11]。对比分析结果表明，不同脂肪酶的相对分子质量、热稳定性、pH稳定性等指标存在明显差异性，同时相应的等电点等也各有不同。不过一般情况下其最适作用温度区间都为38~45℃。脂肪酶的生产方法有很多，可总体上划分为三类，也就是生物以发酵法，化学法合成、从动植物器官提取法，对比分析可知在具体应用领域，化学合成法、提取法的操作很复杂，存在明显的局限。而微生物发酵法的优势表现为，微生物资源多，方便操作，易发生遗传变异，适用范围广，底物专一性，因而可很好的满足工业生产要求，同时产品纯度高。因而这种方法的应用比例在不断提高，并成为工业脂肪酶主要的来源。微生物中细菌、真菌中的这种酶含量高，微生物脂肪酶的底物特异性高，可以很好的满足工业生产要求，在生产高纯酶制剂方面广泛应用。
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