银杏叶黄酮对自由基和亚硝酸盐的清除作用
目 录
1 引言 1
1.1 黄酮类化合物的简介 1
1.2 银杏叶黄酮的提取工艺 1
1.3 银杏叶黄酮对自由基和亚硝酸盐的清除作用 3
1.4 本课题研究的目的和意义 4
2 材料与方法 4
2.1 实验原料 4
2.2 实验试剂 4
2.3 实验设备 5
2.4 实验方法 5
3 结果与分析 9
3.1 芦丁标准曲线 9
3.2 提取银杏叶黄酮的单因素实验 9
3.3 正交试验法优化银杏叶黄酮的提取条件 11
3.4 银杏叶黄酮对自由基的清除作用 12
3.5 银杏叶黄酮对亚硝酸盐的清除作用 14
结 论 15
致 谢 16
参 考 文 献 17
1 引言
银杏又叫白果，是我国的特产植物，它的叶子和果实是较好的医药材料，药用价值高。我国占有世界70%以上的银杏树资源，每年产干叶约1万t。黄酮类、菇内酷类和酚类是银杏叶中的主要有效成分,另外还有生物碱、聚异戊二烯、多糖等等[1-5]。黄酮类化合物是银杏叶中非常重要的生理活性物，它具有良好的抗氧化作用,是一种天然及有效的抗氧化剂。它能够预防和治疗心脑血管疾病、老年痴呆症、抗氧化等许多症状，与此同时，银杏叶的提取物也能用于研制营养保健品和化妆品等。因此，国内外学者门对银杏叶中有效成分的研究和开发越来越关注 [6]。
随着研究方法和技术的不断提高,黄酮类化合物许多新的种类和机理作用也随之出现,因此对银杏叶中黄酮类化合物的提取有了更高的要求。在质量标准方面，银杏叶提取物一开始只要求 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: *351916072*
活性成分银杏总黄酮的含量在21%以上,然而现在则要求银杏叶总黄酮能够达到24%以上,总内酷达到6%以上[7]。因此，怎样充分地利用银杏中的有效成分成为目前最为重要的问题。
1.1 黄酮类化合物的简介
黄酮类化合物属于酚类化合物，在银杏叶中黄酮类化合物中占有较大成分比例，最常见的是黄酮和黄酮醇，还有双氢黄酮(醇)、双黄酮、异黄酮、黄烷醇、橙酮、查尔酮、花色苷及新黄酮类等[8]。根据以前的研究得知银杏叶中的黄酮类化合物有35种之多。知道具体组织结构的有20种。水、稀乙醇、乙酸乙酷等极性溶剂一般能溶解黄酮类化合物，但难被乙醚、氯仿和苯溶解。黄酮类分子中的甲氧基、甲基、不饱和烃基增多时，可以降低这些分子在极性溶剂中的溶解度。分子中含有多个酚性烃基，一般显弱酸性。
1.2 银杏叶黄酮的提取工艺
1.2.1 超声波提取法
超声波提取法已被采用于对植物中的生物碱、苷类、生物活性物质等的提取研究。根源为超声波的特殊物理性，利用快速机械振动波，而这种机械波由压电换能器产生用来降低目标萃取物与样品基体之间的作用力，达到固─液萃取分离的目的。超声波提取方法具有操作简单，提取率高，能耗低等特点，有效的避免高温高压对中药材内有效成分的破坏。超声波提取法作为提取黄酮的一类新型方法，它有着广阔的发展前景。这种方法具有能耗低、效率高、不破坏有效成分的特点。超声作用在较低温度下时，对水浸提银杏叶中黄酮苷的工艺研究表明，超声可以强化水浸提效果，达到省时、高效、节能的目的[9]。
1.2.2 微波提取法
最近发展起来的微波辅助提取技术，特点有提取时间短、溶剂用量少及提取效率高等，得到越来越大的重视。吉林大学化学学院刘忠英[10]利用微波辅助提取法(MAE)提取刺五加中的黄酮类化合物，通过正交实验考察了微波提取条件，结果表明用50%乙醇为溶剂，700kPa为提取压力，提取10min，料液比为1∶20时黄酮提取率最佳，与索氏提取法相比，提取率可提高40%，能大大提高黄酮提取率和缩短溶剂萃取所需的时间。
1.2.3 超临界流体萃取法
目前，提取植物中的活性成分时经常使用这种超临界流体萃取法。此方与有机溶剂法相比，具有提取快、无溶剂残留、不易分解破坏活性成分和热不稳定成分等优点，通过温度的控制和压力以及用不同的调节改性剂的类别和数量，还可以实现选择性萃取和分离纯化目的。上海华东理工大学国家重点实验室，邓启焕等[11]以银杏叶有效成分分离为对象，建立一套超临界流体小试、中试装置和实验方法，提取到银杏黄酮含量为28%，银杏内酯含量为7.2%，均高于国际现行公认的质量标准。
1.2.4 溶剂萃取法
有两种萃取方法，分别是无机溶剂萃取法和有机溶剂萃取法。利用银杏叶黄酮能溶于碱水或甲醇等有机溶剂特性来提取银杏叶黄酮。其中，目前国内外提取银杏叶中黄酮类物质，有机溶剂萃取法是最为广泛的方法，可用冷浸法或加热抽提法提取，乙醇和甲醇是最为常见的浸提液[12]。
1.2.5 复合酶法
在传统的溶剂提取方法的基础上，发展出一种新型的提取方法为复合酶法，根据植物药材细胞壁的组成成分，利用酶反应所具有的高度专一性等特点，选择对应的酶，使细胞壁水解或降解，使有效成分充分暴露出来，溶解、混悬于溶剂中，而达到提取细胞内有效成分的目的[12]。
1.2.6 其他方法
水提法、蒸汽爆破提取法、大孔树脂法等。
1.3 银杏叶黄酮对自由基和亚硝酸盐的清除作用
1.3.1 自由基和亚硝酸盐的危害
自由基内含有一个不成对电子的原子团，包括羟自由、氧自由基等，自由基利用破坏生物细胞膜、降低酶活性，损伤DNA、破坏蛋白质结构和脂质等使生物体生命活动受到阻碍。此外，人体经常摄入亚硝酸盐会造成高铁血红蛋白症，这种症状会导致智力迟钝；还可与胺类物质作用形成亚硝基胺，亚硝基胺具有较强的致癌致畸作用[13]。
1.3.2 对自由基的清除作用
（1）对羟自由基的清除作用
测定银杏叶黄酮对羟自由基的清除作用时通过水杨酸法。在水杨酸体系中，水杨酸的作用为显色，从而可测得溶液中剩余自由基的含量，以此判断抗氧化性。FeSO4和H2O2反应产生羟自由基，羟自由基氧化水杨酸产生2，3-二羟基苯甲酸，由2,3-二羟基苯甲酸在510nm处的吸光值确定羟自由基的含量，吸光值越大，证明羟自由基越多。在反应体系中加入具有清除用的物质减少该吸光值，通过测定吸光值明确加入的物质清除羟自由基效果[14]。
（2）对氧自由基的清除作用
通过邻苯三酚法测定银杏叶黄铜对氧自由基的清除作用。在碱性条件下，邻苯三酚能迅速自氧化，释放出O2-，生成带色的中间产物，而且邻苯三酚自氧化速率与生成O2-的浓度呈正相关关系，中间产物于420nm波长时有强烈光吸收。抗氧化剂能催化O2-与H+结合形成O2和 H2O2，明显的阻止了中间产物的积累，故可通过紫外可见光分光光度法来定量研究抗氧化剂在这体系中对 O2-的清除作用，曲线评价抗氧化剂的抗氧化能力。索金玲[15]等采用此法评价了石榴叶总黄酮提取物的体外抗氧化能力，最后证明，石榴叶总黄酮抑制邻苯三酚自氧化能力高于维生素C[12]。
3.1 芦丁标准曲线
以吸光值为横坐标，芦丁浓度为纵坐标，绘制标准曲线如图2所示。
1 引言 1
1.1 黄酮类化合物的简介 1
1.2 银杏叶黄酮的提取工艺 1
1.3 银杏叶黄酮对自由基和亚硝酸盐的清除作用 3
1.4 本课题研究的目的和意义 4
2 材料与方法 4
2.1 实验原料 4
2.2 实验试剂 4
2.3 实验设备 5
2.4 实验方法 5
3 结果与分析 9
3.1 芦丁标准曲线 9
3.2 提取银杏叶黄酮的单因素实验 9
3.3 正交试验法优化银杏叶黄酮的提取条件 11
3.4 银杏叶黄酮对自由基的清除作用 12
3.5 银杏叶黄酮对亚硝酸盐的清除作用 14
结 论 15
致 谢 16
参 考 文 献 17
1 引言
银杏又叫白果，是我国的特产植物，它的叶子和果实是较好的医药材料，药用价值高。我国占有世界70%以上的银杏树资源，每年产干叶约1万t。黄酮类、菇内酷类和酚类是银杏叶中的主要有效成分,另外还有生物碱、聚异戊二烯、多糖等等[1-5]。黄酮类化合物是银杏叶中非常重要的生理活性物，它具有良好的抗氧化作用,是一种天然及有效的抗氧化剂。它能够预防和治疗心脑血管疾病、老年痴呆症、抗氧化等许多症状，与此同时，银杏叶的提取物也能用于研制营养保健品和化妆品等。因此，国内外学者门对银杏叶中有效成分的研究和开发越来越关注 [6]。
随着研究方法和技术的不断提高,黄酮类化合物许多新的种类和机理作用也随之出现,因此对银杏叶中黄酮类化合物的提取有了更高的要求。在质量标准方面，银杏叶提取物一开始只要求 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: *351916072*
活性成分银杏总黄酮的含量在21%以上,然而现在则要求银杏叶总黄酮能够达到24%以上,总内酷达到6%以上[7]。因此，怎样充分地利用银杏中的有效成分成为目前最为重要的问题。
1.1 黄酮类化合物的简介
黄酮类化合物属于酚类化合物，在银杏叶中黄酮类化合物中占有较大成分比例，最常见的是黄酮和黄酮醇，还有双氢黄酮(醇)、双黄酮、异黄酮、黄烷醇、橙酮、查尔酮、花色苷及新黄酮类等[8]。根据以前的研究得知银杏叶中的黄酮类化合物有35种之多。知道具体组织结构的有20种。水、稀乙醇、乙酸乙酷等极性溶剂一般能溶解黄酮类化合物，但难被乙醚、氯仿和苯溶解。黄酮类分子中的甲氧基、甲基、不饱和烃基增多时，可以降低这些分子在极性溶剂中的溶解度。分子中含有多个酚性烃基，一般显弱酸性。
1.2 银杏叶黄酮的提取工艺
1.2.1 超声波提取法
超声波提取法已被采用于对植物中的生物碱、苷类、生物活性物质等的提取研究。根源为超声波的特殊物理性，利用快速机械振动波，而这种机械波由压电换能器产生用来降低目标萃取物与样品基体之间的作用力，达到固─液萃取分离的目的。超声波提取方法具有操作简单，提取率高，能耗低等特点，有效的避免高温高压对中药材内有效成分的破坏。超声波提取法作为提取黄酮的一类新型方法，它有着广阔的发展前景。这种方法具有能耗低、效率高、不破坏有效成分的特点。超声作用在较低温度下时，对水浸提银杏叶中黄酮苷的工艺研究表明，超声可以强化水浸提效果，达到省时、高效、节能的目的[9]。
1.2.2 微波提取法
最近发展起来的微波辅助提取技术，特点有提取时间短、溶剂用量少及提取效率高等，得到越来越大的重视。吉林大学化学学院刘忠英[10]利用微波辅助提取法(MAE)提取刺五加中的黄酮类化合物，通过正交实验考察了微波提取条件，结果表明用50%乙醇为溶剂，700kPa为提取压力，提取10min，料液比为1∶20时黄酮提取率最佳，与索氏提取法相比，提取率可提高40%，能大大提高黄酮提取率和缩短溶剂萃取所需的时间。
1.2.3 超临界流体萃取法
目前，提取植物中的活性成分时经常使用这种超临界流体萃取法。此方与有机溶剂法相比，具有提取快、无溶剂残留、不易分解破坏活性成分和热不稳定成分等优点，通过温度的控制和压力以及用不同的调节改性剂的类别和数量，还可以实现选择性萃取和分离纯化目的。上海华东理工大学国家重点实验室，邓启焕等[11]以银杏叶有效成分分离为对象，建立一套超临界流体小试、中试装置和实验方法，提取到银杏黄酮含量为28%，银杏内酯含量为7.2%，均高于国际现行公认的质量标准。
1.2.4 溶剂萃取法
有两种萃取方法，分别是无机溶剂萃取法和有机溶剂萃取法。利用银杏叶黄酮能溶于碱水或甲醇等有机溶剂特性来提取银杏叶黄酮。其中，目前国内外提取银杏叶中黄酮类物质，有机溶剂萃取法是最为广泛的方法，可用冷浸法或加热抽提法提取，乙醇和甲醇是最为常见的浸提液[12]。
1.2.5 复合酶法
在传统的溶剂提取方法的基础上，发展出一种新型的提取方法为复合酶法，根据植物药材细胞壁的组成成分，利用酶反应所具有的高度专一性等特点，选择对应的酶，使细胞壁水解或降解，使有效成分充分暴露出来，溶解、混悬于溶剂中，而达到提取细胞内有效成分的目的[12]。
1.2.6 其他方法
水提法、蒸汽爆破提取法、大孔树脂法等。
1.3 银杏叶黄酮对自由基和亚硝酸盐的清除作用
1.3.1 自由基和亚硝酸盐的危害
自由基内含有一个不成对电子的原子团，包括羟自由、氧自由基等，自由基利用破坏生物细胞膜、降低酶活性，损伤DNA、破坏蛋白质结构和脂质等使生物体生命活动受到阻碍。此外，人体经常摄入亚硝酸盐会造成高铁血红蛋白症，这种症状会导致智力迟钝；还可与胺类物质作用形成亚硝基胺，亚硝基胺具有较强的致癌致畸作用[13]。
1.3.2 对自由基的清除作用
（1）对羟自由基的清除作用
测定银杏叶黄酮对羟自由基的清除作用时通过水杨酸法。在水杨酸体系中，水杨酸的作用为显色，从而可测得溶液中剩余自由基的含量，以此判断抗氧化性。FeSO4和H2O2反应产生羟自由基，羟自由基氧化水杨酸产生2，3-二羟基苯甲酸，由2,3-二羟基苯甲酸在510nm处的吸光值确定羟自由基的含量，吸光值越大，证明羟自由基越多。在反应体系中加入具有清除用的物质减少该吸光值，通过测定吸光值明确加入的物质清除羟自由基效果[14]。
（2）对氧自由基的清除作用
通过邻苯三酚法测定银杏叶黄铜对氧自由基的清除作用。在碱性条件下，邻苯三酚能迅速自氧化，释放出O2-，生成带色的中间产物，而且邻苯三酚自氧化速率与生成O2-的浓度呈正相关关系，中间产物于420nm波长时有强烈光吸收。抗氧化剂能催化O2-与H+结合形成O2和 H2O2，明显的阻止了中间产物的积累，故可通过紫外可见光分光光度法来定量研究抗氧化剂在这体系中对 O2-的清除作用，曲线评价抗氧化剂的抗氧化能力。索金玲[15]等采用此法评价了石榴叶总黄酮提取物的体外抗氧化能力，最后证明，石榴叶总黄酮抑制邻苯三酚自氧化能力高于维生素C[12]。
3.1 芦丁标准曲线
以吸光值为横坐标，芦丁浓度为纵坐标，绘制标准曲线如图2所示。
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