土壤微生物来源的庆大霉素耐药基因的异源表达(附件)
细菌对于庆大霉素类抗生素的耐药机制主要有产生钝化酶使得药物失活和减少及吸收药物在细菌体内的累积两种方式。其中氨基糖苷钝化酶主要有 N-乙酰基转移酶(AAC)、O-核苷转移酶(ANT) 和O-磷酸转移酶(APH)，等，本次实验所研究的庆大霉素钝化酶的特异性完全不同于已知的任何一种酶，是一种全新机制的钝化酶。实验内容是将已经筛选的得到的耐药阳性菌株进行亚克隆构建，并将带有目的基因的质粒电转如宿主E. coliRosseta，前期使用了蛋白伴侣的方法和E. coli BL21菌作为宿主，但得到的结果很不理想。并通过对电转化后的受体菌的抗性选择培养，得到含有庆大霉素耐药基因宿主菌体，再把菌体接种到大瓶进行培养，获得含有庆大霉素耐药基因的异源表达蛋白的液体培养基，然后对液体培养基中的抗性蛋白进行纯化，并采用SDS-PAGE电泳法来验证耐药基因的表达效果。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言（或绪论）1
1．材料与方法2
1.1.2材料 2
1.2．方法 3
1.2.1.庆大霉素耐药基因阳性亚克隆质粒的制备3
1.2.21.2.2目的质粒的双酶切验证4
1.2.3电转化感受态细胞的制备5
1.2.4电转化5
1.2.5大霉素耐药基因的异源诱导表达5
1.2.6庆大霉素耐药基因蛋白的纯化6
1.2.7庆大霉素耐药基因蛋白的鉴定6
2.结果分析7
2.1纯化蛋白的收集8
2.2 pET30a(+)质粒 8
2.3表达载体电转后的质粒 9
2．4庆大霉素耐药基因蛋白的纯化与鉴定 9
3.讨论 9
致谢9
参考文献10
土壤微生物来源的庆大霉素耐药基因的异源表达
食品质量与安全 马涛
引言
引言:庆大霉素是我国独立自主研发的氨基糖苷类广谱抗生素，是我国成立以来最伟大的科技成果之一。[1]于1967年开始研制，成功鉴定在1969年底，[3[]而正是由于被大量 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: &351916072&
和广泛的使用，导致很多细菌对庆大霉素产生耐药性，大大减低了庆大霉素的抑菌效果，加速了它的淘汰。氨基糖苷类抗生素钝化酶是细菌对庆大霉素耐药最主要的原因,他们子中特定氨基和羟基的化学修饰使修饰后的药物与细菌核糖体的结合能力大大降低,从而产生严重的耐药现象。氨基糖苷钝化酶有主要有 N乙酰基转移酶(AAC)、O核苷转移酶(ANT) 和O磷酸转移酶(APH), 这些钝化酶对典型氨基糖苷类抗生素(卡那霉素和庆霉素及其衍生物)的修饰位点对AAC来说有 3 , 2′, 6′位 ,对 AN T来说有 4′, 2′位 ,对 APH 来说有 3′, 2″。这些钝化酶由质粒编码并与转座子相连,质粒交换和转座子传递加速了耐药基因在不同细菌间的传播,导致了严重复杂的耐药现象。[ 5、8]
本次实验所研究的庆大霉素钝化酶特异性不同于已知的任何一种酶，这对研究和探索新型耐药机制和耐药菌的产生有很重要的意义 [6]
材料与方法
1．1.1材料试剂
（1）.云南文库中已经筛选得到的庆大霉素（Gentamicin）耐药基因阳性克隆的阳性亚克隆，编号2150。
（2）. LB培养基配制方法：胰蛋白胨 5 g ，酵母粉 2.5 g， 氯化钠5 g ，5 M氢氧化钠250 uL（固体另加10 g琼脂）。灭菌备用（500mL）。{5}
（3）. PTG诱导剂：Weight 0.2383 g IPTG. 溶于1 mLdd H2O，0.22 μm滤膜低温抽滤.
（4）.庆大霉素：30 mg/ml，配置10ml备用。
（5）.大肠杆菌Rosseta。
（6）.氯化镍50 mM,配置100 mL备用。
（7）.60%甘油，配置50 mL备用。
（8）.Washing Buffer：Tris 12.114 g 氯化钠 5.844 g PH 8.0 （2L）。
（9）.Lysis Buffer（细胞裂解液）：Tris 3.0285 g 氯化钠 2.922 g Triton（1%）5mL PH8.0 配制500mL备用。
（10）.Imidazole（咪唑） ：Tris 3.0285 g 氯化钠 1.461 g Imidazole 17.025 g PH8.0 配置500ml备用。
（11）.脱色液：95%乙醇：冰醋酸：水 = 45：5：50（体积比，配制500ml备用）
(12).保存液：7%冰醋酸。
(13).染色液：0.3125 g的考马斯亮蓝R250 + 5 mL95%酒精 + 25 mL冰醋酸，用250 mL容量瓶加超纯水定容至250 mL 备用。
(14).质粒小提盒1个。
(15).配置分离胶 表11
凝胶浓度
7.5%
10%
12%
15%
18%
20%
双蒸水/ml
9.6
8.1
6.7
4.7
2.7
1.5
1.5mol/L Tris.HCl(pH8.8)/ml
5
5
5
5
5
5
10%(W/V)SDS/μL
200
200
200
200
200
200
Acr/Bis(30%)/ml
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言（或绪论）1
1．材料与方法2
1.1.2材料 2
1.2．方法 3
1.2.1.庆大霉素耐药基因阳性亚克隆质粒的制备3
1.2.21.2.2目的质粒的双酶切验证4
1.2.3电转化感受态细胞的制备5
1.2.4电转化5
1.2.5大霉素耐药基因的异源诱导表达5
1.2.6庆大霉素耐药基因蛋白的纯化6
1.2.7庆大霉素耐药基因蛋白的鉴定6
2.结果分析7
2.1纯化蛋白的收集8
2.2 pET30a(+)质粒 8
2.3表达载体电转后的质粒 9
2．4庆大霉素耐药基因蛋白的纯化与鉴定 9
3.讨论 9
致谢9
参考文献10
土壤微生物来源的庆大霉素耐药基因的异源表达
食品质量与安全 马涛
引言
引言:庆大霉素是我国独立自主研发的氨基糖苷类广谱抗生素，是我国成立以来最伟大的科技成果之一。[1]于1967年开始研制，成功鉴定在1969年底，[3[]而正是由于被大量 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: &351916072&
和广泛的使用，导致很多细菌对庆大霉素产生耐药性，大大减低了庆大霉素的抑菌效果，加速了它的淘汰。氨基糖苷类抗生素钝化酶是细菌对庆大霉素耐药最主要的原因,他们子中特定氨基和羟基的化学修饰使修饰后的药物与细菌核糖体的结合能力大大降低,从而产生严重的耐药现象。氨基糖苷钝化酶有主要有 N乙酰基转移酶(AAC)、O核苷转移酶(ANT) 和O磷酸转移酶(APH), 这些钝化酶对典型氨基糖苷类抗生素(卡那霉素和庆霉素及其衍生物)的修饰位点对AAC来说有 3 , 2′, 6′位 ,对 AN T来说有 4′, 2′位 ,对 APH 来说有 3′, 2″。这些钝化酶由质粒编码并与转座子相连,质粒交换和转座子传递加速了耐药基因在不同细菌间的传播,导致了严重复杂的耐药现象。[ 5、8]
本次实验所研究的庆大霉素钝化酶特异性不同于已知的任何一种酶，这对研究和探索新型耐药机制和耐药菌的产生有很重要的意义 [6]
材料与方法
1．1.1材料试剂
（1）.云南文库中已经筛选得到的庆大霉素（Gentamicin）耐药基因阳性克隆的阳性亚克隆，编号2150。
（2）. LB培养基配制方法：胰蛋白胨 5 g ，酵母粉 2.5 g， 氯化钠5 g ，5 M氢氧化钠250 uL（固体另加10 g琼脂）。灭菌备用（500mL）。{5}
（3）. PTG诱导剂：Weight 0.2383 g IPTG. 溶于1 mLdd H2O，0.22 μm滤膜低温抽滤.
（4）.庆大霉素：30 mg/ml，配置10ml备用。
（5）.大肠杆菌Rosseta。
（6）.氯化镍50 mM,配置100 mL备用。
（7）.60%甘油，配置50 mL备用。
（8）.Washing Buffer：Tris 12.114 g 氯化钠 5.844 g PH 8.0 （2L）。
（9）.Lysis Buffer（细胞裂解液）：Tris 3.0285 g 氯化钠 2.922 g Triton（1%）5mL PH8.0 配制500mL备用。
（10）.Imidazole（咪唑） ：Tris 3.0285 g 氯化钠 1.461 g Imidazole 17.025 g PH8.0 配置500ml备用。
（11）.脱色液：95%乙醇：冰醋酸：水 = 45：5：50（体积比，配制500ml备用）
(12).保存液：7%冰醋酸。
(13).染色液：0.3125 g的考马斯亮蓝R250 + 5 mL95%酒精 + 25 mL冰醋酸，用250 mL容量瓶加超纯水定容至250 mL 备用。
(14).质粒小提盒1个。
(15).配置分离胶 表11
凝胶浓度
7.5%
10%
12%
15%
18%
20%
双蒸水/ml
9.6
8.1
6.7
4.7
2.7
1.5
1.5mol/L Tris.HCl(pH8.8)/ml
5
5
5
5
5
5
10%(W/V)SDS/μL
200
200
200
200
200
200
Acr/Bis(30%)/ml
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