胡萝卜瓣化型细胞质雄性不育atp9基因的分离和分析
细胞质雄性不育（Cytoplasmic Male Sterility）是高等植物中广泛存在的一种现象。研究表明atp9基因在拟南芥，洋葱，小麦等其它作物的雄性不育机理中起到了不可或缺的作用。本研究分别以胡萝卜瓣化型细胞质雄性不育系和保持系的atp9基因为研究对象，进一步克隆与分析，确定胡萝卜细胞质雄性不育与atp9基因的关系。结果表明与保持系相比atp9基因在胡萝卜不育系中有缺失片段与碱基对的替换的现象，推测胡萝卜瓣化型细胞质不育与atp9基因的变异有重要关系。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言（或绪论）1
1材料与方法2
1.1材料 2
1.2实验方法 2
1.2.1提取mtDNA2
1.2.2atp9基因片段的克隆3
1.2.3atp9基因分析3
2结果与分析3
2.1胡萝卜atp9基因的克隆3
2.2胡萝卜atp9基因序列比对4
2.3胡萝卜CMS与atp9的关系4
3讨论 6
致谢6
参考文献6
胡萝卜瓣化型细胞质雄性不育atp9基因的分离和分析
引言
引言：胡萝卜(Daucus carota L.)作为一种根菜类蔬菜作物，营养丰富，为世界产量前十的蔬菜作物之一[1]。由于花器管小而造成的人工去雄困难，对胡萝卜杂种优势的利用一直停滞不前，直到人们发现了雄性不育并将其运用在胡萝卜杂种的生产繁育中 [2]。利用雄性不育现象可以简化人工去雄的过程，提高杂种纯度，降低人工。胡萝卜雄性不育虽然对植物体本身没有益处，但人类可以通过利用该现象来产生具有杂种优势在的种子。胡萝卜雄性不育的具体机理还尚未了解，因此进一步探索胡萝卜雄性不育的原理，掌握调节胡萝卜雄性不育的调控原理是有必要的，从而为利用胡萝卜雄性不育提供理论基础。
细胞质雄性在多种植物中都有表现，具体现象为小孢子不能正常生长、不能产生花粉或花粉败育，但卵细胞发育正常、可以正常接受花粉受精，是最广泛应用的一种利用细胞质雄性不育的育种方式，其遗传规律不同 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: @351916072@
于正常的孟德尔法则而呈母系遗传。CMS主要是由细胞质中的遗传物质控制的，但细胞质中的绝大部分物质的生产与活动受细胞核控制，所以现在细胞质雄性不育多指核－质共同作用的情况。Ciorrents［3］1908年首次报道了CMS 之后，随后在亚麻、玉米、小麦等多种植物中也发现了CMS。目前，CMS 已在150种植物中被发现。胡萝卜的雄性不育可分为“褐药型”（ ba型）与“瓣化型”（ Pt型），其中“瓣化型”具体表现为雄蕊不能正常发育而变态形成花瓣状或叶片状， 缺失小孢子发生组织［4］。Ferse［5］研究认为, 瓣化型雄性不育是两对相互独立的显性核基因(M1 ,M2) 和不育细胞质因子（SP）结果 由于不育基因(M)处于显性状态,在F1中找不到这种不育类型的保持系,必须用（SP）m1m1,m2m2，这种可育类型通过进行回交, 则可发现显性基因位点。
细胞质基因同时影响胡萝卜的两种雄性不育变异。研究认为,胡萝卜雄性不育主要受线粒体的基因重组影响而与叶绿体无关。叶绿体基因组表现稳定, 而线粒体基因组(mtDNA)不仅在不同物种，亚种，栽培品种间有明显的变化，在相同栽培品种的不同植株的中也有显著区别［6］。Shcieke 等［7］研究发现,胡萝卜不育性表现与线粒体DNA的特异碱基顺序及其转录和转译模式密切相关。育性恢复基因与不育基因的定位和标记对胡萝卜杂交育种具有非常重要的意义。虽然雄性不育对植物自身没有有益帮助，但在利用杂种优势进行育种及研究时有巨大的帮助。国内外生物学研究的热点之一就是植物细胞质雄性不育及其相关机理，现已取得了较大进展。研究发现雄性不育现象与细胞质关系密切：首先，胡适宜等［8］人的研究发现作为能量代谢的主要细胞器的线粒体的其结构与数量可能对CMS现象产生影响。Scheik等［9］对胡萝卜两种细胞质雄性不育系的叶绿体 DNA（cpDNA）和线粒体DNA（mtDNA）的限制性片断分析阐明：保持系与不育系细胞存在差异，线粒体之间的的限制性片段都是不同的；线粒体结构不受导入核育性恢复基因的恢复育性的影响；有些线粒体基因的转录方式和基因组环境在不育和可育胞质间存在差异。因此，不同的胡萝卜胞质不育表现型影响线粒体特异的碱基顺序的重排、转录以及翻译模式。Chaahal ［10］对胡萝卜两系的线粒体DNA进行酶切和Southern印迹杂交，也发现可育细胞质和不育细胞质存在明显差异。
周玮等［11］证实在烟草中未编辑的atp9 mRNA能导致烟草不育,烟草不育系及其同型保持系中的atp9不同。包括atp9 mRNA在序列、氨基酸、3核苷酸模式等方面的一维信息的差异 ,从而导致ATP的合成受到影响, 是引起雄性器官发育不良,从而产生雄性不育。段继强等［12］在通过保持系和恢复系苎麻雄性不育系atp9基因对比,发现了在编码区3′端存在的碱基的差异和缺失。同时通过RTPCR得到,雄性不育系atp9 基因在现蕾期和盛花期有大量表达。他们推断是不育系atp9基因序列差异引起翻译产物的差异或基因异常表达影响了ATP的代谢,从而使不育系雄蕊败育 ,而产生CMS性状。
1 材料与方法
1．1 材料
高代纯合的胡萝卜瓣化型CMS保持系442B和不育系442A，种植于大学江浦农场，各取保持系与不育系的新鲜幼嫩叶片，取样后分别用锡箔纸包好并用液氮进行速冻，贮存于80°C保存备用。
1.2实验方法
1．2 .1提取mtDNA 提取胡萝卜瓣化型CMS保持系442B和不育系442A的mtDNA；胡萝卜mtDNA提取，分别以两系胡萝卜的幼嫩叶片为材料，来提取mtDNA。方法参照段继强等[13]提取苎麻atp9基因时的步骤取适量贮藏与80°C的胡萝卜瓣化型CMS保持系442B和不育系442A的幼嫩叶片，放入事先预冷过的研钵中，加石英砂与液氮进行研磨，研磨一段时间后加入适量细胞分离器缓冲液[300mmol/L蔗糖，50mmol/L TrisCl(pH8.0),5mmol/L EDTA,0.2%BSA,0.05%半胱氨酸，5%PVP，2%β巯基乙醇]，加入后继续研磨，同时继续加入该缓冲液至10mL/g FW，之后用八层纱布进行过滤，将所得滤液以1000r/min离心10min取上清液再以2000r/min离心10min，取上清，再以15000r/min离心15min弃上清。向沉淀中加入少许事先预冷过得缓冲液，通过毛笔避免沉淀附着管底，再加细胞分离缓冲液至1mL/g FW，再以2000r/min离心10min，取上清再以15000r/min离心15min弃上清，所得沉淀即为粗线粒体沉淀，之后通过蔗糖衬垫缓冲液及数次离心得到纯化的线粒体沉淀，最后从线粒体中提取出实验所需的胡萝卜瓣化型CMS保持系442B和不育系442A的mtDNA。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言（或绪论）1
1材料与方法2
1.1材料 2
1.2实验方法 2
1.2.1提取mtDNA2
1.2.2atp9基因片段的克隆3
1.2.3atp9基因分析3
2结果与分析3
2.1胡萝卜atp9基因的克隆3
2.2胡萝卜atp9基因序列比对4
2.3胡萝卜CMS与atp9的关系4
3讨论 6
致谢6
参考文献6
胡萝卜瓣化型细胞质雄性不育atp9基因的分离和分析
引言
引言：胡萝卜(Daucus carota L.)作为一种根菜类蔬菜作物，营养丰富，为世界产量前十的蔬菜作物之一[1]。由于花器管小而造成的人工去雄困难，对胡萝卜杂种优势的利用一直停滞不前，直到人们发现了雄性不育并将其运用在胡萝卜杂种的生产繁育中 [2]。利用雄性不育现象可以简化人工去雄的过程，提高杂种纯度，降低人工。胡萝卜雄性不育虽然对植物体本身没有益处，但人类可以通过利用该现象来产生具有杂种优势在的种子。胡萝卜雄性不育的具体机理还尚未了解，因此进一步探索胡萝卜雄性不育的原理，掌握调节胡萝卜雄性不育的调控原理是有必要的，从而为利用胡萝卜雄性不育提供理论基础。
细胞质雄性在多种植物中都有表现，具体现象为小孢子不能正常生长、不能产生花粉或花粉败育，但卵细胞发育正常、可以正常接受花粉受精，是最广泛应用的一种利用细胞质雄性不育的育种方式，其遗传规律不同 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: @351916072@
于正常的孟德尔法则而呈母系遗传。CMS主要是由细胞质中的遗传物质控制的，但细胞质中的绝大部分物质的生产与活动受细胞核控制，所以现在细胞质雄性不育多指核－质共同作用的情况。Ciorrents［3］1908年首次报道了CMS 之后，随后在亚麻、玉米、小麦等多种植物中也发现了CMS。目前，CMS 已在150种植物中被发现。胡萝卜的雄性不育可分为“褐药型”（ ba型）与“瓣化型”（ Pt型），其中“瓣化型”具体表现为雄蕊不能正常发育而变态形成花瓣状或叶片状， 缺失小孢子发生组织［4］。Ferse［5］研究认为, 瓣化型雄性不育是两对相互独立的显性核基因(M1 ,M2) 和不育细胞质因子（SP）结果 由于不育基因(M)处于显性状态,在F1中找不到这种不育类型的保持系,必须用（SP）m1m1,m2m2，这种可育类型通过进行回交, 则可发现显性基因位点。
细胞质基因同时影响胡萝卜的两种雄性不育变异。研究认为,胡萝卜雄性不育主要受线粒体的基因重组影响而与叶绿体无关。叶绿体基因组表现稳定, 而线粒体基因组(mtDNA)不仅在不同物种，亚种，栽培品种间有明显的变化，在相同栽培品种的不同植株的中也有显著区别［6］。Shcieke 等［7］研究发现,胡萝卜不育性表现与线粒体DNA的特异碱基顺序及其转录和转译模式密切相关。育性恢复基因与不育基因的定位和标记对胡萝卜杂交育种具有非常重要的意义。虽然雄性不育对植物自身没有有益帮助，但在利用杂种优势进行育种及研究时有巨大的帮助。国内外生物学研究的热点之一就是植物细胞质雄性不育及其相关机理，现已取得了较大进展。研究发现雄性不育现象与细胞质关系密切：首先，胡适宜等［8］人的研究发现作为能量代谢的主要细胞器的线粒体的其结构与数量可能对CMS现象产生影响。Scheik等［9］对胡萝卜两种细胞质雄性不育系的叶绿体 DNA（cpDNA）和线粒体DNA（mtDNA）的限制性片断分析阐明：保持系与不育系细胞存在差异，线粒体之间的的限制性片段都是不同的；线粒体结构不受导入核育性恢复基因的恢复育性的影响；有些线粒体基因的转录方式和基因组环境在不育和可育胞质间存在差异。因此，不同的胡萝卜胞质不育表现型影响线粒体特异的碱基顺序的重排、转录以及翻译模式。Chaahal ［10］对胡萝卜两系的线粒体DNA进行酶切和Southern印迹杂交，也发现可育细胞质和不育细胞质存在明显差异。
周玮等［11］证实在烟草中未编辑的atp9 mRNA能导致烟草不育,烟草不育系及其同型保持系中的atp9不同。包括atp9 mRNA在序列、氨基酸、3核苷酸模式等方面的一维信息的差异 ,从而导致ATP的合成受到影响, 是引起雄性器官发育不良,从而产生雄性不育。段继强等［12］在通过保持系和恢复系苎麻雄性不育系atp9基因对比,发现了在编码区3′端存在的碱基的差异和缺失。同时通过RTPCR得到,雄性不育系atp9 基因在现蕾期和盛花期有大量表达。他们推断是不育系atp9基因序列差异引起翻译产物的差异或基因异常表达影响了ATP的代谢,从而使不育系雄蕊败育 ,而产生CMS性状。
1 材料与方法
1．1 材料
高代纯合的胡萝卜瓣化型CMS保持系442B和不育系442A，种植于大学江浦农场，各取保持系与不育系的新鲜幼嫩叶片，取样后分别用锡箔纸包好并用液氮进行速冻，贮存于80°C保存备用。
1.2实验方法
1．2 .1提取mtDNA 提取胡萝卜瓣化型CMS保持系442B和不育系442A的mtDNA；胡萝卜mtDNA提取，分别以两系胡萝卜的幼嫩叶片为材料，来提取mtDNA。方法参照段继强等[13]提取苎麻atp9基因时的步骤取适量贮藏与80°C的胡萝卜瓣化型CMS保持系442B和不育系442A的幼嫩叶片，放入事先预冷过的研钵中，加石英砂与液氮进行研磨，研磨一段时间后加入适量细胞分离器缓冲液[300mmol/L蔗糖，50mmol/L TrisCl(pH8.0),5mmol/L EDTA,0.2%BSA,0.05%半胱氨酸，5%PVP，2%β巯基乙醇]，加入后继续研磨，同时继续加入该缓冲液至10mL/g FW，之后用八层纱布进行过滤，将所得滤液以1000r/min离心10min取上清液再以2000r/min离心10min，取上清，再以15000r/min离心15min弃上清。向沉淀中加入少许事先预冷过得缓冲液，通过毛笔避免沉淀附着管底，再加细胞分离缓冲液至1mL/g FW，再以2000r/min离心10min，取上清再以15000r/min离心15min弃上清，所得沉淀即为粗线粒体沉淀，之后通过蔗糖衬垫缓冲液及数次离心得到纯化的线粒体沉淀，最后从线粒体中提取出实验所需的胡萝卜瓣化型CMS保持系442B和不育系442A的mtDNA。
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