芹菜中转录因子agdreb1的分离和表达研究
摘要：【目的】DREB类转录因子是植物AP2/ERF转录因子家族中一个重要的亚家族，参与植物对逆境的应答，是植物适应逆境的重要调节因子之一。本文从不同品种芹菜中分离DREB类转录因子基因，并研究其表达情况，以进一步研究芹菜中非生物胁迫逆境调控。【方法】基于芹菜（Apium graveolens L.）转录组数据，分别从2 个芹菜品种‘津南实芹’和‘文图拉’中克隆得到一个编码芹菜DREB类转录因子的基因AgDREB1。采用生物信息学方法对AgDREB1的氨基酸组成、理化性质、进化关系、空间结构等进行了分析。通过实时定量PCR方法进行AgDREB1基因在‘津南实芹’和‘文图拉’中表达分析。【结果】分析结果表明，来源于‘津南实芹’和‘文图拉’的AgDREB1基因全长分别为495 bp和492 bp，分别编码165和164个氨基酸。芹菜中AgDREB1转录因子等电点为9.64左右，包含1 个α螺旋和3个 β折叠结构，进化关系上属于DREB亚族中的A5组。芹菜AgDREB1转录因子与其他物种的DREB转录因子具有较高的一致性。实时定量PCR分析表明，AgDREB1基因在‘津南实芹’和‘文图拉’根中的表达较高，对低温、高温、干旱和盐胁迫等非生物胁迫有响应。【结论】本文从芹菜中克隆获得一个逆境相关的DREB类转录因子基因AgDREB1，通过基因表达分析发现，芹菜中AgDREB1基因在根中表达最高，而且该基因与芹菜非生物胁迫相关。
目录
1 材料与方法 2
1.1 植物材料、菌种与质粒 3
1.2 芹菜总RNA的提取及cDNA的合成 3
1.3芹菜AgDREB1基因的克隆 3
1.4 序列生物信息学分析 3
1.5 实时定量PCR反应 3
2 结果与分析 4
2.1 芹菜中AgDREB1基因的克隆和序列分析 4
2.2芹菜中AgDREB1转录因子氨基酸序列同源性和结构域分析 4
2.3 芹菜AgDREB1转录因子氨基酸序列组成与分析 4
2.4芹菜AgDREB1转录因子亲水/疏水性分析 5
2.5芹菜AgDREB1转录因子的进化树分析 5
2.6芹菜AgDREB1转录因子二级结构和三级结构预测
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^3^5^1^9^1^6^0^7^2^*
与分析 7
2.7 AgDREB1基因在芹菜不同组织部位的表达情况 8
2.8 AgDREB1基因在芹菜不同非生物逆境下的表达情况 9
3 讨论 9
致谢 10
参考文献: 10
芹菜中转录因子基因AgDREB1的分离
与表达研究
园艺111班 邵天恒 14111123
引言
植物生长过程中易受到各种非生物逆境的影响，如低温、高温、干旱和盐胁迫等[1]。这些胁迫影响植物生长发育，严重时甚至导致植株死亡。每年由于逆境导致的农业经济损失难以估量[2]。近年来，转录因子在植物逆境调控响应中的重要作用逐渐受到重视，并且已经在分子生物学水平上进行了大量研究。
转录因子又称反式作用因子，是能与顺式元件发生特异性互作，并对DNA转录具有激活或抑制作用的DNA结合蛋白。在高等植物中，转录因子能够调节各类基因的时空表达[3]。研究证实，植物中的一些转录因子与植物防卫反应有关，如AP2/ERF类、bZIP类、WRKY类和MYB类等[45]。其中，AP2/ERF家族主要分为DREB、ERF、AP2和RAV 等4个亚族，其中DREB亚族又可以进一步分为A1~A6组[6]。DREB类转录因子在非生物胁迫抗性响应中起重要的作用[712]。Liu[2,7]等从拟南芥中分离得到DREB类转录因子DREB1A、DREB1B、DREB1C和DREB2A、DREB2B；并发现DREB1A基因表达受低温诱导作用十分快速且强烈，DREB2A基因的表达受干旱和高盐胁迫诱导。Jaglo等[3]在拟南芥远缘物种小麦、黑麦、番茄中也发现了DREB亚家族转录因子。此外，Gilmour等[4]还发现DREB转录因子能促进一系列抗逆功能基因的转录以及脯氨酸和糖含量的提升。
芹菜（Apium graveolens L.）为伞形科（Apiaceae）芹属中一、二年生草本植物，含有丰富的胡萝卜素、维生素和挥发性芳香成分，不仅具有食用价值，还具有优良的药用价值[12]。‘津南实芹’是天津津南区选育的优良品种，植株高大，颜色淡绿，适应性广；‘文图拉’引自美国，植株高大，株型紧凑，在低温条件下生长较快。本研究分别从以上2 个芹菜品种中克隆获得AgDREB1基因，利用生物信息学方法对所克隆基因进行较为详尽的分析，并且采用荧光定量PCR方法研究了AgDREB1基因在芹菜中的组织特异性表达，还对AgDREB1基因在低温、高温、干旱和盐胁迫等非生物逆境条件下的表达进行了研究，以期为进一步深入研究芹菜的抗逆机制提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 植物材料、菌种与质粒
植物材料为本实验室保存的芹菜品种 ‘津南实芹’和‘文图拉’，种植于大学作物遗传与种质创新国家重点实验室人工气候室。采集种植2个月的芹菜植株的根、茎、叶等为试验材料。同时，对生长期相同的‘津南实芹’和‘文图拉’幼苗分别进行4 种逆境胁迫处理：将幼苗分批转移至4 ℃或38 ℃生长室培养，模拟低温、高温逆境；以20 %的PEG6000溶液和200 mmol.L1的NaCl分别模拟干旱和盐胁迫逆境对芹菜幼苗进行处理，并设ddH20处理为对照组。分别于处理后1、2、4、8、24 h取叶片样本并立即采取液氮速冻后，保存于80℃冰箱中。
大肠杆菌DH5α由本实验室保存；质粒载体pMD18T、DNA分子量标准品，Ex Taq PCR聚合酶和限制性内切酶等均为大连TaKaRa公司产品。
1.2 芹菜总RNA的提取及cDNA的合成
芹菜总RNA提取按照RNA试剂盒（RNAsimply total RNA Kit，Tiangen公司）说明书进行，用Prime RT Reagent Kit（大连TaKaRa公司）将提取的总RNA反转录成cDNA。
1.3芹菜AgDREB1基因的克隆
根据本实验室测定的芹菜‘津南实芹’和‘文图拉’转录组数据，检索并拼接出芹菜AgDREB1基因序列，设计1 对引物，（上游引物AGDREBF:5’ATGATCAAGAGGAGAGA GATGG3’；下游引物AGDREBR:5’CCATAGATGTTGAAGGTGATTT3’）。分别以‘‘津南实芹’和‘文图拉’的cDNA为模板进行扩增，PCR反应条件为：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，54 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共30 个循环；72 ℃ 10 min。PCR产物经1.2 g.L1琼脂糖凝胶电泳回收后，连接到pMD18T载体上并转化大肠杆菌DH5α，经PCR鉴定后由南京金斯瑞生物科技有限公司完成测序。
1.4 序列生物信息学分析
同源性计算利用NCBI网站BLAST程序。氨基酸组成与多序列比对采用Clustal X软件，并用NJ法完成系统进化树的构建，使用MEGA5软件对系统进化树进行测试和编辑，生成报告图形。氨基酸成分、蛋白质相对分子质量和等电点分析采用ProtParam软件（http://web.expasy.org/protparam/），蛋白质疏水/亲水性分析采用ProtScale软件（http://web.expasy.org/protscale/），信号肽分析利用SignalP 4.1 Server软件（http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）完成，跨膜结构域分析利用TMpred Server软件（http://www.ch.embnet.org/software/TMPRED_form.html）完成。蛋白质二级结构使用SOPM软件(http://npsapbil.ibcp.fr/cgibin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopm.html)进行分析，三级结构结构模型通过SwissModel(http://swiss model.expasy.org/)建立。
目录
1 材料与方法 2
1.1 植物材料、菌种与质粒 3
1.2 芹菜总RNA的提取及cDNA的合成 3
1.3芹菜AgDREB1基因的克隆 3
1.4 序列生物信息学分析 3
1.5 实时定量PCR反应 3
2 结果与分析 4
2.1 芹菜中AgDREB1基因的克隆和序列分析 4
2.2芹菜中AgDREB1转录因子氨基酸序列同源性和结构域分析 4
2.3 芹菜AgDREB1转录因子氨基酸序列组成与分析 4
2.4芹菜AgDREB1转录因子亲水/疏水性分析 5
2.5芹菜AgDREB1转录因子的进化树分析 5
2.6芹菜AgDREB1转录因子二级结构和三级结构预测
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^3^5^1^9^1^6^0^7^2^*
与分析 7
2.7 AgDREB1基因在芹菜不同组织部位的表达情况 8
2.8 AgDREB1基因在芹菜不同非生物逆境下的表达情况 9
3 讨论 9
致谢 10
参考文献: 10
芹菜中转录因子基因AgDREB1的分离
与表达研究
园艺111班 邵天恒 14111123
引言
植物生长过程中易受到各种非生物逆境的影响，如低温、高温、干旱和盐胁迫等[1]。这些胁迫影响植物生长发育，严重时甚至导致植株死亡。每年由于逆境导致的农业经济损失难以估量[2]。近年来，转录因子在植物逆境调控响应中的重要作用逐渐受到重视，并且已经在分子生物学水平上进行了大量研究。
转录因子又称反式作用因子，是能与顺式元件发生特异性互作，并对DNA转录具有激活或抑制作用的DNA结合蛋白。在高等植物中，转录因子能够调节各类基因的时空表达[3]。研究证实，植物中的一些转录因子与植物防卫反应有关，如AP2/ERF类、bZIP类、WRKY类和MYB类等[45]。其中，AP2/ERF家族主要分为DREB、ERF、AP2和RAV 等4个亚族，其中DREB亚族又可以进一步分为A1~A6组[6]。DREB类转录因子在非生物胁迫抗性响应中起重要的作用[712]。Liu[2,7]等从拟南芥中分离得到DREB类转录因子DREB1A、DREB1B、DREB1C和DREB2A、DREB2B；并发现DREB1A基因表达受低温诱导作用十分快速且强烈，DREB2A基因的表达受干旱和高盐胁迫诱导。Jaglo等[3]在拟南芥远缘物种小麦、黑麦、番茄中也发现了DREB亚家族转录因子。此外，Gilmour等[4]还发现DREB转录因子能促进一系列抗逆功能基因的转录以及脯氨酸和糖含量的提升。
芹菜（Apium graveolens L.）为伞形科（Apiaceae）芹属中一、二年生草本植物，含有丰富的胡萝卜素、维生素和挥发性芳香成分，不仅具有食用价值，还具有优良的药用价值[12]。‘津南实芹’是天津津南区选育的优良品种，植株高大，颜色淡绿，适应性广；‘文图拉’引自美国，植株高大，株型紧凑，在低温条件下生长较快。本研究分别从以上2 个芹菜品种中克隆获得AgDREB1基因，利用生物信息学方法对所克隆基因进行较为详尽的分析，并且采用荧光定量PCR方法研究了AgDREB1基因在芹菜中的组织特异性表达，还对AgDREB1基因在低温、高温、干旱和盐胁迫等非生物逆境条件下的表达进行了研究，以期为进一步深入研究芹菜的抗逆机制提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 植物材料、菌种与质粒
植物材料为本实验室保存的芹菜品种 ‘津南实芹’和‘文图拉’，种植于大学作物遗传与种质创新国家重点实验室人工气候室。采集种植2个月的芹菜植株的根、茎、叶等为试验材料。同时，对生长期相同的‘津南实芹’和‘文图拉’幼苗分别进行4 种逆境胁迫处理：将幼苗分批转移至4 ℃或38 ℃生长室培养，模拟低温、高温逆境；以20 %的PEG6000溶液和200 mmol.L1的NaCl分别模拟干旱和盐胁迫逆境对芹菜幼苗进行处理，并设ddH20处理为对照组。分别于处理后1、2、4、8、24 h取叶片样本并立即采取液氮速冻后，保存于80℃冰箱中。
大肠杆菌DH5α由本实验室保存；质粒载体pMD18T、DNA分子量标准品，Ex Taq PCR聚合酶和限制性内切酶等均为大连TaKaRa公司产品。
1.2 芹菜总RNA的提取及cDNA的合成
芹菜总RNA提取按照RNA试剂盒（RNAsimply total RNA Kit，Tiangen公司）说明书进行，用Prime RT Reagent Kit（大连TaKaRa公司）将提取的总RNA反转录成cDNA。
1.3芹菜AgDREB1基因的克隆
根据本实验室测定的芹菜‘津南实芹’和‘文图拉’转录组数据，检索并拼接出芹菜AgDREB1基因序列，设计1 对引物，（上游引物AGDREBF:5’ATGATCAAGAGGAGAGA GATGG3’；下游引物AGDREBR:5’CCATAGATGTTGAAGGTGATTT3’）。分别以‘‘津南实芹’和‘文图拉’的cDNA为模板进行扩增，PCR反应条件为：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，54 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共30 个循环；72 ℃ 10 min。PCR产物经1.2 g.L1琼脂糖凝胶电泳回收后，连接到pMD18T载体上并转化大肠杆菌DH5α，经PCR鉴定后由南京金斯瑞生物科技有限公司完成测序。
1.4 序列生物信息学分析
同源性计算利用NCBI网站BLAST程序。氨基酸组成与多序列比对采用Clustal X软件，并用NJ法完成系统进化树的构建，使用MEGA5软件对系统进化树进行测试和编辑，生成报告图形。氨基酸成分、蛋白质相对分子质量和等电点分析采用ProtParam软件（http://web.expasy.org/protparam/），蛋白质疏水/亲水性分析采用ProtScale软件（http://web.expasy.org/protscale/），信号肽分析利用SignalP 4.1 Server软件（http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）完成，跨膜结构域分析利用TMpred Server软件（http://www.ch.embnet.org/software/TMPRED_form.html）完成。蛋白质二级结构使用SOPM软件(http://npsapbil.ibcp.fr/cgibin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopm.html)进行分析，三级结构结构模型通过SwissModel(http://swiss model.expasy.org/)建立。
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