菊花cmftl1可变剪切的遗传转化和鉴定
摘要：用农杆菌介导法，以叶片为外植体，将含有CmFTL1的可变剪切（CmFTLastIn1-1、CmFTLastIn1-2、CmFTLastIn1-3）的表达载体导入典型的短日照切花菊‘神马’(Dendranthema X grandif lorum cv.‘Jinba’)中，得到112株抗性植株，SDS提取DNA分析表明CmFT的可变剪切基因已导入菊花中，共获得42株转基因植株。其中叶盘浸染法产生CmFTLastIn1-1植株41株，获得转基因植株7株；CmFTLastIn1-2植株34株，转基因植株19株；CmFTLastIn1-3植株37株，转基因植株16株。转化率分别为17.07%、55.89%和43.24%。提取RNA，RT-PCR定量鉴定，转基因植株与载体沉默植株对比发现，转基因植株中CmFTLastIn1-1、CmFTLastIn1-2、CmFTLastIn1-3转录的RNA量明显较高，CmFTLastIn1-1、CmFTLastIn1-2、CmFTLastIn1-3可在‘神马’中正常转录表达。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1、材料与方法2
1.1材料与培养基 2
1.2方法 2
1.2.1菊花‘神马’无菌苗的获得2
1.2.2‘神马’的遗传转化2
1.2.3鉴定3
2结果与分析4
2.1菊花抗性植株的获得4
2.2分子鉴定 5
2.2.1转化植株PCR检测5
2.2.2阳性植株RTPCR荧光定量检测5
3讨论6
致谢7
参考文献7
菊花CmFTL1可变剪切的遗传转化和鉴定
引言
引言
植物主要有四种开花途径：光周期途径、春化途径、赤霉素途径及自主开花途径（王志清等，2012）。光周期是其中一个诱导植物成花的关键因子，通过控制光周期途径来调控植物开花是花期育种的重要途径之一（Boss et al.，2004；Abe et al.，2005）。菊花是典型的短日照植物，自然花
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072*
期位于1011月，其花芽分化、成花过程均受到光周期的严格控制——短日照促进花芽分化，长日照则抑制。目前，在菊花生产中，普遍通过改变光照时间来控制菊花的开放时间，这样耗费了巨大的人力物力，设备与资源成本很高。
目前，科学工作者们已经开始利用转基因技术对菊花进行改良，并获得不同于普通菊花花期的转基因菊花。1999年，邵寒霜等将LEY基因与CaMV35S启动子构建成表达载体转化菊花，转基因植株中有三株比正常植株分别提早65天、67天、70天开花，两株分别推迟78天、90天开花（邵寒霜等，1999）。将拟南芥AP1基因转入地被菊品种“玉人面”中,获得11株转基因植株,其中两株系花期提前约15d(吕晋慧2005)。丁焱(2009)将甘菊中LFY同源基因DFL转化甘菊,转基因株系比对照植株有明显的高生长优势,且可提前开花17d。惠婕(2009)将拟南芥phyA基因转化地被菊品种‘粉地毯’中,在普通光照条件下,获得的当年生转基因植株比对照提前花期16d,次年扦插苗花期提前22d。从拟南芥基因组中克隆了全长PHYA基因,构建了植物表达载体,通过根癌农杆菌LBA4404转化地被匍匐小菊‘粉地毯’,得到4株PCR反应呈阳性的转基因株系。结果发现,与对照相比,转基因株系花期显著提前（惠婕等，2011）。菊花 MADS 基因HAM75，HAM92，CDM111转入白雪 （White Snowdon）中，使其提早开花（Shulga et al.，2011）。Morita（2012）将菊花乙烯受体基因mDGERS1（etr14）转入SeiMarine 中，SeiMarine提早开花。
此外，选择性剪接(alternaltive splicing)也可应用于观赏植物的花期调控。选择性剪切，也叫可变剪接，是指从同一个mRNA前体中通过选择不同的剪接位点组合产生多个不同成熟mRNA的过程；这是一种转录后RNA 水平上调控基因表达的重要机制；研究表明，选择性剪接在生物发育、病源菌防卫反应、逆境胁迫反应等过程中起着重要作用（周新成等，2012）。
目前，对菊花FT基因存在可变剪切的研究较少。前期在菊花体内检测到了CmFTL1的可变剪切转录本的存在，分别是CmFTL1astIn11、CmFTL1astIn12、CmFTL1astIn13。CmFTL1astIn11、CmFTL1astIn12和CmFTL1astIn13都是CmFTL1保留了第一个内含子的可变剪切转录本，只是保留的第一个内含子序列长短不一，导致了翻译的氨基酸序列的不同。本研究以切花菊品种‘神马’为材料，对菊花CmFTL1可变剪切转录本进行遗传转化与鉴定。通过农杆菌介导的叶盘浸染法把CmFT的可变剪切的表达载体转入菊花，并结合分子鉴定技术，以对CmFTL1可变剪切转录本的功能进行探讨。
1 材料与方法
1．1 材料与培养基
材料为切花菊‘神马’(Dendranthema X grandif lorum cv.‘Jinba’)，含CmFTLastIn11、CmFTLastIn12、CmFTLastIn13表达载体的农杆菌菌株由大学园艺学院观赏园艺系提供。
预培养培养基：MS+6BA 1mg/L +NAA 0.5mg/L；脱羧培养基：MS+6BA 1mg/L +NAA 0.5 mg/L，500 mg/LCarb；继代培养基：MS + 6BA 1 mg/L +NAA 0.5 mg/L + 350mg/L Carb + 12 mg/L Hyg，MS + 6BA 1 mg/L +NAA 0.5 mg/L + 300mg/L Carb + 10 mg/L Hyg，MS + 6BA 1 mg/L +NAA 0.3 mg/L + 250mg/L Carb + 8 mg/L Hyg，MS + 6BA 1 mg/L +NAA 0.3 mg/L + 200mg/L Carb + 8 mg/L Hyg；生根培养基：MS+8 mg/L Hyg。
1．2 方法
1．2．1菊花‘神马’无菌苗的获得
采健壮苗期的‘神马’茎尖，去掉叶片后用毛笔刷茎段，再用自来水冲，洗干净后，剪成带有23个叶芽的顶端茎段，用纱布包裹后，在超净台中用75%酒精摇30 s，再用15%的H2O2洗两次，每次5min，后用无菌水洗5次，每次不少于3min。拆开纱布后，将茎段放在灭过菌的滤纸上，用镊子将茎段插到MS培养基中。
1．2．2 ‘神马’的遗传转化
(1)受体材料的预培养
将无菌苗叶片在滤纸上切成约0.5×0.5 cm2大小的正方形叶盘，近轴面向下接种于培养基上进行预培养，时间为23d。
(2)农杆菌培养
将储藏的含表达载体pMDC43In11、pMDC43In12、pMDC43In13的农杆菌进行活化：进行解冻后，在培养基上划线培养。从平板上挑取活化的单菌落，接种到含有相应抗生素的培养基中，在恒温摇床中培养，28℃，180rpm，培养至OD=0.50.6之间，即可用于转化。
将菌液转移到50 ml离心管中，6000rpm，5 min。离心后获得的沉淀为农杆菌菌体。
(3)侵染
在超净工作台上，弃上清，将获得的农杆菌用等体积的MS液体培养基悬浮（也可根据材料对农杆菌的敏感情况进行相应的稀释），将菌液倒入无菌的小玻璃培养皿中，从培养瓶中取出预培养过的叶盘，放入菌液中，浸泡适当时间（10 min），取出叶盘，置于滤纸上，吸干叶盘附着的菌液。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1、材料与方法2
1.1材料与培养基 2
1.2方法 2
1.2.1菊花‘神马’无菌苗的获得2
1.2.2‘神马’的遗传转化2
1.2.3鉴定3
2结果与分析4
2.1菊花抗性植株的获得4
2.2分子鉴定 5
2.2.1转化植株PCR检测5
2.2.2阳性植株RTPCR荧光定量检测5
3讨论6
致谢7
参考文献7
菊花CmFTL1可变剪切的遗传转化和鉴定
引言
引言
植物主要有四种开花途径：光周期途径、春化途径、赤霉素途径及自主开花途径（王志清等，2012）。光周期是其中一个诱导植物成花的关键因子，通过控制光周期途径来调控植物开花是花期育种的重要途径之一（Boss et al.，2004；Abe et al.，2005）。菊花是典型的短日照植物，自然花
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072*
期位于1011月，其花芽分化、成花过程均受到光周期的严格控制——短日照促进花芽分化，长日照则抑制。目前，在菊花生产中，普遍通过改变光照时间来控制菊花的开放时间，这样耗费了巨大的人力物力，设备与资源成本很高。
目前，科学工作者们已经开始利用转基因技术对菊花进行改良，并获得不同于普通菊花花期的转基因菊花。1999年，邵寒霜等将LEY基因与CaMV35S启动子构建成表达载体转化菊花，转基因植株中有三株比正常植株分别提早65天、67天、70天开花，两株分别推迟78天、90天开花（邵寒霜等，1999）。将拟南芥AP1基因转入地被菊品种“玉人面”中,获得11株转基因植株,其中两株系花期提前约15d(吕晋慧2005)。丁焱(2009)将甘菊中LFY同源基因DFL转化甘菊,转基因株系比对照植株有明显的高生长优势,且可提前开花17d。惠婕(2009)将拟南芥phyA基因转化地被菊品种‘粉地毯’中,在普通光照条件下,获得的当年生转基因植株比对照提前花期16d,次年扦插苗花期提前22d。从拟南芥基因组中克隆了全长PHYA基因,构建了植物表达载体,通过根癌农杆菌LBA4404转化地被匍匐小菊‘粉地毯’,得到4株PCR反应呈阳性的转基因株系。结果发现,与对照相比,转基因株系花期显著提前（惠婕等，2011）。菊花 MADS 基因HAM75，HAM92，CDM111转入白雪 （White Snowdon）中，使其提早开花（Shulga et al.，2011）。Morita（2012）将菊花乙烯受体基因mDGERS1（etr14）转入SeiMarine 中，SeiMarine提早开花。
此外，选择性剪接(alternaltive splicing)也可应用于观赏植物的花期调控。选择性剪切，也叫可变剪接，是指从同一个mRNA前体中通过选择不同的剪接位点组合产生多个不同成熟mRNA的过程；这是一种转录后RNA 水平上调控基因表达的重要机制；研究表明，选择性剪接在生物发育、病源菌防卫反应、逆境胁迫反应等过程中起着重要作用（周新成等，2012）。
目前，对菊花FT基因存在可变剪切的研究较少。前期在菊花体内检测到了CmFTL1的可变剪切转录本的存在，分别是CmFTL1astIn11、CmFTL1astIn12、CmFTL1astIn13。CmFTL1astIn11、CmFTL1astIn12和CmFTL1astIn13都是CmFTL1保留了第一个内含子的可变剪切转录本，只是保留的第一个内含子序列长短不一，导致了翻译的氨基酸序列的不同。本研究以切花菊品种‘神马’为材料，对菊花CmFTL1可变剪切转录本进行遗传转化与鉴定。通过农杆菌介导的叶盘浸染法把CmFT的可变剪切的表达载体转入菊花，并结合分子鉴定技术，以对CmFTL1可变剪切转录本的功能进行探讨。
1 材料与方法
1．1 材料与培养基
材料为切花菊‘神马’(Dendranthema X grandif lorum cv.‘Jinba’)，含CmFTLastIn11、CmFTLastIn12、CmFTLastIn13表达载体的农杆菌菌株由大学园艺学院观赏园艺系提供。
预培养培养基：MS+6BA 1mg/L +NAA 0.5mg/L；脱羧培养基：MS+6BA 1mg/L +NAA 0.5 mg/L，500 mg/LCarb；继代培养基：MS + 6BA 1 mg/L +NAA 0.5 mg/L + 350mg/L Carb + 12 mg/L Hyg，MS + 6BA 1 mg/L +NAA 0.5 mg/L + 300mg/L Carb + 10 mg/L Hyg，MS + 6BA 1 mg/L +NAA 0.3 mg/L + 250mg/L Carb + 8 mg/L Hyg，MS + 6BA 1 mg/L +NAA 0.3 mg/L + 200mg/L Carb + 8 mg/L Hyg；生根培养基：MS+8 mg/L Hyg。
1．2 方法
1．2．1菊花‘神马’无菌苗的获得
采健壮苗期的‘神马’茎尖，去掉叶片后用毛笔刷茎段，再用自来水冲，洗干净后，剪成带有23个叶芽的顶端茎段，用纱布包裹后，在超净台中用75%酒精摇30 s，再用15%的H2O2洗两次，每次5min，后用无菌水洗5次，每次不少于3min。拆开纱布后，将茎段放在灭过菌的滤纸上，用镊子将茎段插到MS培养基中。
1．2．2 ‘神马’的遗传转化
(1)受体材料的预培养
将无菌苗叶片在滤纸上切成约0.5×0.5 cm2大小的正方形叶盘，近轴面向下接种于培养基上进行预培养，时间为23d。
(2)农杆菌培养
将储藏的含表达载体pMDC43In11、pMDC43In12、pMDC43In13的农杆菌进行活化：进行解冻后，在培养基上划线培养。从平板上挑取活化的单菌落，接种到含有相应抗生素的培养基中，在恒温摇床中培养，28℃，180rpm，培养至OD=0.50.6之间，即可用于转化。
将菌液转移到50 ml离心管中，6000rpm，5 min。离心后获得的沉淀为农杆菌菌体。
(3)侵染
在超净工作台上，弃上清，将获得的农杆菌用等体积的MS液体培养基悬浮（也可根据材料对农杆菌的敏感情况进行相应的稀释），将菌液倒入无菌的小玻璃培养皿中，从培养瓶中取出预培养过的叶盘，放入菌液中，浸泡适当时间（10 min），取出叶盘，置于滤纸上，吸干叶盘附着的菌液。
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