枳athb8基因全长的克隆和生物信息学分析
摘要：ATHB8是拟南芥生长发育过程中重要的调控基因。利用生物信息学方法以拟南芥ATHB8基因cDNA序列作为模板，对枳EST数据库进行同源检索筛选，电子克隆出枳ATHB8基因cDNA序列。以枳根、茎、叶、花、果器官cDNA 为模板，根据电子克隆的枳基因cDNA序列设计特异引物，分别利用RACE 技术和特异PCR 技术获得该基因3’末端和5’末端，序列拼接后获得枳的ATHB8基因的cDNA全长。该cDNA的全长为2490bp。 ATHB8核苷酸序列有一个1536 bp完整的开放读码框（ORF），其5’与3’末端非翻译区分别为321bp和272 bp。其中，3’末端含有17bp的Ploy+（A）。该cDNA推倒编码了829个氨基酸，具备HD-ZIP转录因子家族中的保守结构域。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言（或绪论）1
1材料与方法2
1.1电子克隆 2
1.2实验克隆 2
1.2.2材料2
1.2.2 质粒、菌株和试剂2
1.2.3 RNA的提取与mRNA的纯化 2
1.2.4 cDNA的合成3
1.2.5 基因3’和5’末端PCR扩增3
1.2.6 ATHB8基因ORF的扩增 3
1.2.7 ATHB8基因的生物信息学分析3
2 结果与分析3
2.1枳Pt ATHB8 cDNA全长的获得3
2.2 枳ATHB8氨基酸序列分析5
3 讨论 5
致谢5
参考文献6
枳ATHB8基因全长的克隆和生物信息学分析
引言
引言：枳[Poncirus trifoliata (L.) Raf.]是柑橘的重要的优良砧木之一，也是柑橘学研究的重要材料。它是柑橘基因组学研究，尤其是EST测序，以及柑橘分子生物学研究的重要对象（CristofaniYaly et al., 2007）。在枳上开展ATHB8基因的表达分析，对于认识基因如何调控其花器官发育、童期转变以及提高砧木育种效率都有重要的理论价值。砧
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^3^5^1^9^1^6^0^7^2^*
木对嫁接苗的寿命，生长，开花结实以及适应性等都有较大的影响，必须了解砧木的作用和特点，才能同时选择最佳的砧木和接穗的组合。例如温州蜜柑嫁接在甜橙或酸橙上，品质较差；嫁接在柚树则果实皮厚，含糖量较低；嫁接在枳上则果实大，色泽鲜艳，成熟期早，酸低糖高。
本研究采用生物信息学电子克隆的方法以拟南芥的基因序列为模板，对柑橘EST数据库进行同源检索筛选，并对候选的 ESTs序列进行反复延伸，获得柑橘ATHB8基因cDNA的全长序列，并以枳根、茎、叶、花、果构建的cDNA文库为模板，经RACE技术和RTPCR获得枳的cDNA全长，命名为ATHB8 。
同源域—亮氨酸拉链蛋白（HDZip）是高等植物中特有的一类转录因子，包含高度保守的同源异型域（HD），HD羧基末端与亮氨酸拉链域(LZ)紧密相连。通过LZ结构域的相互作用, HDZip蛋白以二聚体的形式与靶DNA 结合。目前，多种植物中都分离鉴定了HDZip蛋白, 包括单子叶和双子叶植物、C3 和C4植物，其中很多的HDZip蛋白已经开展进一步研究，它们的结构和功能与模式植物中的HDZip蛋白存在很多相似之处。在植物中，HDZip蛋白存在于各个组织、器官中，它们在高等植物的生长、发育、形态建成，以及生物和非生物胁迫等逆境应答中起着重要的调控作用, 而且四个亚类的HDZip蛋白各自具有不同的功能。
根据HDZip结合的特异性DNA序列, 编码该类蛋白质的基因结构, 以及包含的其他基序及其生理功能，HDZip转录因子可以分为四个亚类(I, II, III和IV)。四个亚家族在植物生长中有着广泛的作用，如器官维管生长、分生组织维持、激素响应调节、环境胁迫应答反应等过程（Ariel等，2007）。如：ATHB1作为第一个被分离研究的类蛋白，对叶细胞的命运确定性起着调节作用（Aoyama等，1995）；ATHB6参与蓝光信号感受（Wang等，2003）；ATHB10、ATML1和PDF2参与表皮层细胞的命运确定等（Abe等，2003）。ATHB8是HDZip III类的成员之一，HDZip III类蛋白主要参与顶端分生组织的分化、维管组织形成、生长素的极性运输、胚胎发育以及近轴区域侧部器官的发育等调控过程。HDZIPⅢ基因家族的5个成员在维管组织中都有表达，其中尤以ATHB 15和ATHB 8两个基因在维管组织中的表达最为明显(Prigge et al., 2005)。试验表明不同的HDZIPⅢ转录因子在维管发育中所起的作用是不同的。例如，当拟南芥过量表达1个ATHB 15突变cDNA时，次生分化减弱，木质化组织比例相对缩小，维管束数目减少(Kim etal., 2005)，说明ATHB 15可能对木质部生成起着负调控作用。而ATHB 8的过量表达则导致拟南芥木质部的合成增加(Baima et al., 2001)，由此可见，ATHB 15和ATHB 8两个基因可能在控制木质部发育的过程中具有相反的调节作用。
1 材料与方法
1.1 ATHB8基因电子克隆
根据不同物种间同源基因的核酸序列相对保守的特点，在GenBank的核酸(nr/nt)数据库中检索拟南芥的ATHB8基因序列，并以拟南芥序列为探针对柑橘属和枳属EST数据库进行BLAST检索，获得与拟南芥ATHB8基因同源的柑橘EST 片段；从获得的柑橘EST片段中选出同源性最高的一条序列，再对柑橘EST 数据库进行BLAST 检索，得到多条与之高度同源的柑橘EST 序列；将获得的EST序列用DNAStar软件进行首尾拼接，获得新的Contig；以获得的Contig 反复对柑橘EST公共数据库进行BLAST 检索、拼接，尽可能获得全长cDNA。
1.2 基因ATHB8的克隆
1.2.1材料
枳(P. trifoliata) 幼年期的根、茎、叶和花；以及成年期的幼叶、老叶、嫩茎、老茎、根、花芽、花，于2016年3月中旬采自江苏省太湖常绿果树技术推广中心—苏州科学研究所，立即投入液氮带回实验室70 ℃保存，用于总RNA的提取。
1.2.2质粒、菌株和试剂
大肠杆菌(Escherichia coli) 菌株DH5(由实验室保存。PowerScriptTM II反转录酶购自Clontech公司，DNase酶Ⅰ、LA Taq酶、Ex Taq酶、pMD18T Simple载体、dNTP、DNA Marker、Hind Ⅲ和XbaⅠ购自TaKaRa公司，RNA 3(末端poly (A)聚合酶（2 U/μL）购自Ambion公司（Ambion, Austin, TX），T4 RNA连接酶和T4 DNA连接酶购自Promega公司（Promega, Madison, WI），SuperScriptTM III RT 和Trizol Reagent购自Invitrogen公司。所用引物由上海英骏生物技术有限公司(Invitrogen)合成，其编号及序列见表1
表1 枳ATHB8基因全长克隆引物序列
Table 1 The primers sequences of target complete cDNA cloning
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言（或绪论）1
1材料与方法2
1.1电子克隆 2
1.2实验克隆 2
1.2.2材料2
1.2.2 质粒、菌株和试剂2
1.2.3 RNA的提取与mRNA的纯化 2
1.2.4 cDNA的合成3
1.2.5 基因3’和5’末端PCR扩增3
1.2.6 ATHB8基因ORF的扩增 3
1.2.7 ATHB8基因的生物信息学分析3
2 结果与分析3
2.1枳Pt ATHB8 cDNA全长的获得3
2.2 枳ATHB8氨基酸序列分析5
3 讨论 5
致谢5
参考文献6
枳ATHB8基因全长的克隆和生物信息学分析
引言
引言：枳[Poncirus trifoliata (L.) Raf.]是柑橘的重要的优良砧木之一，也是柑橘学研究的重要材料。它是柑橘基因组学研究，尤其是EST测序，以及柑橘分子生物学研究的重要对象（CristofaniYaly et al., 2007）。在枳上开展ATHB8基因的表达分析，对于认识基因如何调控其花器官发育、童期转变以及提高砧木育种效率都有重要的理论价值。砧
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^3^5^1^9^1^6^0^7^2^*
木对嫁接苗的寿命，生长，开花结实以及适应性等都有较大的影响，必须了解砧木的作用和特点，才能同时选择最佳的砧木和接穗的组合。例如温州蜜柑嫁接在甜橙或酸橙上，品质较差；嫁接在柚树则果实皮厚，含糖量较低；嫁接在枳上则果实大，色泽鲜艳，成熟期早，酸低糖高。
本研究采用生物信息学电子克隆的方法以拟南芥的基因序列为模板，对柑橘EST数据库进行同源检索筛选，并对候选的 ESTs序列进行反复延伸，获得柑橘ATHB8基因cDNA的全长序列，并以枳根、茎、叶、花、果构建的cDNA文库为模板，经RACE技术和RTPCR获得枳的cDNA全长，命名为ATHB8 。
同源域—亮氨酸拉链蛋白（HDZip）是高等植物中特有的一类转录因子，包含高度保守的同源异型域（HD），HD羧基末端与亮氨酸拉链域(LZ)紧密相连。通过LZ结构域的相互作用, HDZip蛋白以二聚体的形式与靶DNA 结合。目前，多种植物中都分离鉴定了HDZip蛋白, 包括单子叶和双子叶植物、C3 和C4植物，其中很多的HDZip蛋白已经开展进一步研究，它们的结构和功能与模式植物中的HDZip蛋白存在很多相似之处。在植物中，HDZip蛋白存在于各个组织、器官中，它们在高等植物的生长、发育、形态建成，以及生物和非生物胁迫等逆境应答中起着重要的调控作用, 而且四个亚类的HDZip蛋白各自具有不同的功能。
根据HDZip结合的特异性DNA序列, 编码该类蛋白质的基因结构, 以及包含的其他基序及其生理功能，HDZip转录因子可以分为四个亚类(I, II, III和IV)。四个亚家族在植物生长中有着广泛的作用，如器官维管生长、分生组织维持、激素响应调节、环境胁迫应答反应等过程（Ariel等，2007）。如：ATHB1作为第一个被分离研究的类蛋白，对叶细胞的命运确定性起着调节作用（Aoyama等，1995）；ATHB6参与蓝光信号感受（Wang等，2003）；ATHB10、ATML1和PDF2参与表皮层细胞的命运确定等（Abe等，2003）。ATHB8是HDZip III类的成员之一，HDZip III类蛋白主要参与顶端分生组织的分化、维管组织形成、生长素的极性运输、胚胎发育以及近轴区域侧部器官的发育等调控过程。HDZIPⅢ基因家族的5个成员在维管组织中都有表达，其中尤以ATHB 15和ATHB 8两个基因在维管组织中的表达最为明显(Prigge et al., 2005)。试验表明不同的HDZIPⅢ转录因子在维管发育中所起的作用是不同的。例如，当拟南芥过量表达1个ATHB 15突变cDNA时，次生分化减弱，木质化组织比例相对缩小，维管束数目减少(Kim etal., 2005)，说明ATHB 15可能对木质部生成起着负调控作用。而ATHB 8的过量表达则导致拟南芥木质部的合成增加(Baima et al., 2001)，由此可见，ATHB 15和ATHB 8两个基因可能在控制木质部发育的过程中具有相反的调节作用。
1 材料与方法
1.1 ATHB8基因电子克隆
根据不同物种间同源基因的核酸序列相对保守的特点，在GenBank的核酸(nr/nt)数据库中检索拟南芥的ATHB8基因序列，并以拟南芥序列为探针对柑橘属和枳属EST数据库进行BLAST检索，获得与拟南芥ATHB8基因同源的柑橘EST 片段；从获得的柑橘EST片段中选出同源性最高的一条序列，再对柑橘EST 数据库进行BLAST 检索，得到多条与之高度同源的柑橘EST 序列；将获得的EST序列用DNAStar软件进行首尾拼接，获得新的Contig；以获得的Contig 反复对柑橘EST公共数据库进行BLAST 检索、拼接，尽可能获得全长cDNA。
1.2 基因ATHB8的克隆
1.2.1材料
枳(P. trifoliata) 幼年期的根、茎、叶和花；以及成年期的幼叶、老叶、嫩茎、老茎、根、花芽、花，于2016年3月中旬采自江苏省太湖常绿果树技术推广中心—苏州科学研究所，立即投入液氮带回实验室70 ℃保存，用于总RNA的提取。
1.2.2质粒、菌株和试剂
大肠杆菌(Escherichia coli) 菌株DH5(由实验室保存。PowerScriptTM II反转录酶购自Clontech公司，DNase酶Ⅰ、LA Taq酶、Ex Taq酶、pMD18T Simple载体、dNTP、DNA Marker、Hind Ⅲ和XbaⅠ购自TaKaRa公司，RNA 3(末端poly (A)聚合酶（2 U/μL）购自Ambion公司（Ambion, Austin, TX），T4 RNA连接酶和T4 DNA连接酶购自Promega公司（Promega, Madison, WI），SuperScriptTM III RT 和Trizol Reagent购自Invitrogen公司。所用引物由上海英骏生物技术有限公司(Invitrogen)合成，其编号及序列见表1
表1 枳ATHB8基因全长克隆引物序列
Table 1 The primers sequences of target complete cDNA cloning
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