菊花淹水响应基因cmrap2.3的克隆与功能分析
菊花(Chrysanthemum morifolium)是我国十大传统名花之一，栽培历史悠久，在园林观赏和绿化中具有极高的价值。菊花生性强健，但是耐涝性差，常常在生产上或园林规划运用中造成严重的损失。本论文旨在研究菊花淹水响应基因CmRAP2.3的基因序列及其功能，从而初步阐明菊花的淹水胁迫响应机制。本研究以菊花切花品种‘南农雪峰’为实验材料，提取总RNA并反转录cDNA，通过高保真PCR获得CmRAP2.3基因的全长序列；采用实时荧光定量PCR的分析方法，研究了CmRAP2.3基因在淹水环境下的表达，通过酵母单杂交验证了CmRAP2.3基因的转录激活活性，并且利用洋葱表皮细胞瞬时表达系统对该基因进行了亚细胞定位。结果表明，CmRAP2.3基因的开放阅读框为702bp，编码234个氨基酸，并且具有典型的ERF类转录因子家族的DNA结构域。实时荧光定量PCR分析表明，CmRAP2.3基因在淹水条件下出现过量表达。酵母单杂交实验表明该基因具有转录激活活性。亚细胞定位证明该基因定位于细胞核中。初步推断，CmRAP2.3基因参与了植物淹水胁迫的响应过程，并且对植物在淹水环境下的调节起到重要的作用。
目录
摘要 4
关键词 4
Abstract 4
Key words 4
第一章 引言 5
第二章 CmRAP2.3基因克隆与序列分析 6
1 材料与方法 6
1．1 植物材料及处理 6
1．1．1 植物材料 6
1．1．2 处理 6
1．2 实验方法 6
1．2．1 总RNA提取 6
1．2．2 第一链cDNA的合成 6
1．2．3 高保真PCR扩增 7
1．2．4 目的片段连接 8
1．2．5 大肠杆菌转化 8
1．2．6 大肠杆菌菌液检测 8
1．2．7 高保真PCR全长验证 8
1．2．8 序列分析与进化树的构建 9
2 结果与分析 9
2．1 CmRAP2.3的克隆与序列分析 9
2．2 CmRAP2.3的同源性分析与进化树构 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ￥351916072$
建 10
3 讨论 11
第三章 CmRAP2.3基因功能初步分析 11
1 材料与方法 11
1．1 植物材料及处理 11
1．1．1 植物材料 11
1．1．2 处理 11
1．2 实验方法 11
1．2．1 实时荧光定量PCR 11
1．2．2 入门载体的构建 12
1．2．3 目的载体重组 13
1．2．4 转录激活活性测定 14
1．2．5 亚细胞定位 14
2 结果与分析 15
2．1 CmRAP2.3表达模式分析 15
2．2 CmRAP2.3转录激活活性分析 16
2．3 CmRAP2.3亚细胞定位分析 17
3 讨论 17
致谢 19
参考文献 20
附录 21
菊花淹水响应基因CmRAP2.3的克隆与功能分析
引言
引言
菊花(Chrysanthemum morifolium)作为我国十大传统名花之一，具有悠久的栽培历史，自古以来深受我国以及世界人民的喜爱。在我国，本土菊花品种至少有3000种[1]，花型、花色和株型等的种质资源非常丰富，具有极高的观赏价值和园林运用价值。菊花生性强健，适应性强，但是耐涝性差，尤其在炎热的夏季，雨后的积水常常造成菊花大面积死亡[2]。
我国是一个水涝灾害频繁的国家[3]，这导致我国可耕土地的水分过多，对许多植物的正常生长发育造成了很大的危害，常常引起农业作物产量的减产。而菊花的忌涝性与我国目前的水涝灾害情况形成了鲜明的矛盾，这也使得菊花规模化生产遇到极大的阻碍。因此，对菊花的耐涝性基因的分子研究及其新品种培育便具有重大的现实意义。在近几年的研究中，植物在淹水胁迫中涝害状态下的外观表现、代谢影响以及淹水后植物本身的形态响应、生理响应等过程已经有了较为深入的发展，潘澜等曾对植物淹水胁迫的形态学响应[4]以及植物淹水胁迫的生理学机制[5]进行了系统报道。在淹水基因的响应与表达上，已有相关研究表明植物ERF类转录因子对病原物、低温、干旱、高盐、涝害等生物与非生物胁迫具有适应性应答[6]。Bailey等[7]也曾指出，ⅦERFs是可以调节低氧相关基因表达以及响应水淹胁迫的主要转录因子。AP2基因家族成员在植物响应外界胁迫以及生长发育的转录调控具有重要的地位[8]，而ERF是AP2大家族中的一个亚族，其DNA结合域，即ERF区域非常保守。含有ERF区域的转录因子在植物中广泛存在，并且参与植物的生长发育及生理生化反应的信号转导[9]。
近年来，各地关于AP2/ERF家族的基因调控表达分析不断地被研究报道。例如，水稻在对干旱胁迫的应答中，由于OsDERF1基因的过量表达，导致了负调控因子OsAP239基因和 OsERF3基因的激活并表达，OsAP239和 OsERF3结合乙烯使得乙烯合成基因受到抑制，从而增强了水稻的耐旱性[10]。又如，水稻中另一类ERF类转录因子，分别称为SNORKEL1 (SK1)和SNORKEL2 (SK2)基因，它们在乙烯存在的条件下被诱导，从而刺激了赤霉素途径，促进了水稻节间的伸长，使水稻远离水淹环境[11]。在对模式植物拟南芥的研究中，其包含的Group Ⅶ ERF亚族为RAP2.12、AtERF73/HRE1、AtERF71/HRE2、RAP2.2和RAP2.3基因。其中，RAP2.2基因能够对低氧胁迫进行响应，它与RAP2.12共同控制ADH1、PDC1等低氧胁迫相关基因，来缓解低氧环境带给植物体的伤害[12]。
CmRAP2.3基因作为ERF类转录因子的其中一员，在其结构和功能上继承了ERFs对低氧胁迫高度响应的特点，可以预见其在菊花积极响应淹水逆境过程中所发挥的重要的基因转录和调控作用，为培育出耐涝性菊花新品种奠定了重要的物质基础，也为以后关于菊花耐涝性相关基因的研究开展提供了目标和方向，具有重大的实践意义与现实意义。然而，对菊花淹水响应基因CmRAP2.3还未进行更深入的研究，许多基因调控过程以及与其他基因可能存在的互作机制有待进一步完善。
目录
摘要 4
关键词 4
Abstract 4
Key words 4
第一章 引言 5
第二章 CmRAP2.3基因克隆与序列分析 6
1 材料与方法 6
1．1 植物材料及处理 6
1．1．1 植物材料 6
1．1．2 处理 6
1．2 实验方法 6
1．2．1 总RNA提取 6
1．2．2 第一链cDNA的合成 6
1．2．3 高保真PCR扩增 7
1．2．4 目的片段连接 8
1．2．5 大肠杆菌转化 8
1．2．6 大肠杆菌菌液检测 8
1．2．7 高保真PCR全长验证 8
1．2．8 序列分析与进化树的构建 9
2 结果与分析 9
2．1 CmRAP2.3的克隆与序列分析 9
2．2 CmRAP2.3的同源性分析与进化树构 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ￥351916072$
建 10
3 讨论 11
第三章 CmRAP2.3基因功能初步分析 11
1 材料与方法 11
1．1 植物材料及处理 11
1．1．1 植物材料 11
1．1．2 处理 11
1．2 实验方法 11
1．2．1 实时荧光定量PCR 11
1．2．2 入门载体的构建 12
1．2．3 目的载体重组 13
1．2．4 转录激活活性测定 14
1．2．5 亚细胞定位 14
2 结果与分析 15
2．1 CmRAP2.3表达模式分析 15
2．2 CmRAP2.3转录激活活性分析 16
2．3 CmRAP2.3亚细胞定位分析 17
3 讨论 17
致谢 19
参考文献 20
附录 21
菊花淹水响应基因CmRAP2.3的克隆与功能分析
引言
引言
菊花(Chrysanthemum morifolium)作为我国十大传统名花之一，具有悠久的栽培历史，自古以来深受我国以及世界人民的喜爱。在我国，本土菊花品种至少有3000种[1]，花型、花色和株型等的种质资源非常丰富，具有极高的观赏价值和园林运用价值。菊花生性强健，适应性强，但是耐涝性差，尤其在炎热的夏季，雨后的积水常常造成菊花大面积死亡[2]。
我国是一个水涝灾害频繁的国家[3]，这导致我国可耕土地的水分过多，对许多植物的正常生长发育造成了很大的危害，常常引起农业作物产量的减产。而菊花的忌涝性与我国目前的水涝灾害情况形成了鲜明的矛盾，这也使得菊花规模化生产遇到极大的阻碍。因此，对菊花的耐涝性基因的分子研究及其新品种培育便具有重大的现实意义。在近几年的研究中，植物在淹水胁迫中涝害状态下的外观表现、代谢影响以及淹水后植物本身的形态响应、生理响应等过程已经有了较为深入的发展，潘澜等曾对植物淹水胁迫的形态学响应[4]以及植物淹水胁迫的生理学机制[5]进行了系统报道。在淹水基因的响应与表达上，已有相关研究表明植物ERF类转录因子对病原物、低温、干旱、高盐、涝害等生物与非生物胁迫具有适应性应答[6]。Bailey等[7]也曾指出，ⅦERFs是可以调节低氧相关基因表达以及响应水淹胁迫的主要转录因子。AP2基因家族成员在植物响应外界胁迫以及生长发育的转录调控具有重要的地位[8]，而ERF是AP2大家族中的一个亚族，其DNA结合域，即ERF区域非常保守。含有ERF区域的转录因子在植物中广泛存在，并且参与植物的生长发育及生理生化反应的信号转导[9]。
近年来，各地关于AP2/ERF家族的基因调控表达分析不断地被研究报道。例如，水稻在对干旱胁迫的应答中，由于OsDERF1基因的过量表达，导致了负调控因子OsAP239基因和 OsERF3基因的激活并表达，OsAP239和 OsERF3结合乙烯使得乙烯合成基因受到抑制，从而增强了水稻的耐旱性[10]。又如，水稻中另一类ERF类转录因子，分别称为SNORKEL1 (SK1)和SNORKEL2 (SK2)基因，它们在乙烯存在的条件下被诱导，从而刺激了赤霉素途径，促进了水稻节间的伸长，使水稻远离水淹环境[11]。在对模式植物拟南芥的研究中，其包含的Group Ⅶ ERF亚族为RAP2.12、AtERF73/HRE1、AtERF71/HRE2、RAP2.2和RAP2.3基因。其中，RAP2.2基因能够对低氧胁迫进行响应，它与RAP2.12共同控制ADH1、PDC1等低氧胁迫相关基因，来缓解低氧环境带给植物体的伤害[12]。
CmRAP2.3基因作为ERF类转录因子的其中一员，在其结构和功能上继承了ERFs对低氧胁迫高度响应的特点，可以预见其在菊花积极响应淹水逆境过程中所发挥的重要的基因转录和调控作用，为培育出耐涝性菊花新品种奠定了重要的物质基础，也为以后关于菊花耐涝性相关基因的研究开展提供了目标和方向，具有重大的实践意义与现实意义。然而，对菊花淹水响应基因CmRAP2.3还未进行更深入的研究，许多基因调控过程以及与其他基因可能存在的互作机制有待进一步完善。
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