凹土固定复合芽孢杆菌的工艺优化及其对DBP的降解效果研究
目 录
1 引言 1
1.1 邻苯二甲酸二丁酯 1
1.2 污染物的微生物修复 1
1.3 凹土固定化微生物技术 1
1.4 本研究的目的与意义 3
2 材料与方法 3
2.1 试验材料 3
2.2 试验方法 3
3 结果分析 5
3.1 芽孢杆菌母液的浓度确定 5
3.2 DBP含量标准曲线 7
3.3 凹土吸附芽孢杆菌适宜固液比的确定 8
3.4 凹土吸附芽孢杆菌适宜复合比的确定 8
3.5 固定芽孢杆菌适宜载体的确定 9
结论 11
致谢 12
参考文献 13
1 引言
目前，连作障碍已成为农业发展的瓶颈。化感作用是农作物连作障碍形成的重要原因，邻苯二甲酸二丁酯（DBP）作为辣椒主要化感物质之一，对连作障碍起着重要作用[1]。在现代化农业生产中，邻苯二甲酸二丁酯被大面积应用于农膜、杀虫剂、杀菌剂等的生产，因此也已列入农田土壤中最常被检出的有机污染物之一，而且邻苯二甲酸二丁酯也是辣椒作物根系分泌的潜力化感物质[2]。本文对凹土固定化芽孢杆菌对邻苯二甲酸二丁酯的影响进行综述，结合多次优化，阐明固定化芽孢杆菌与邻苯二甲酸二丁酯之间的关系，为有效解决农作物连作障碍问题及进行农作物的生态管理提供科学依据。
1.1 邻苯二甲酸二丁酯
1.1.1 邻苯二甲酸二丁酯的理化性质和来源
邻苯二甲酸二丁酯（DBP）是无色透明液体，具有芳香气味，溶解大多数有机溶剂和泾类，如醇、醚和苯。它作为聚氯乙烯最常用的增塑剂，能够提高制品的诸多性能包括其柔 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^3^5`1^9`1^6^0`7^2#
软性，同时它也常用作胶粘剂和印刷油墨的添加剂[3]。另外DBP也被用作一种杀体外寄生虫药，当然少量存在于土壤中。
1.1.2 邻苯二甲酸二丁酯的危害
在农产品尤其是在辣椒的化感作用中起主要作用的化学物质之一就是DBP。植物通过向环境分泌某些化学物质， 在其周围形成一个微环境区域，从而抑制或促进该区域内其它植物( 包括其自身) 生长的现象称为化感作用，其中自毒现象是化感作用的重要形式之一[4]。自毒作用是当受体和供体同属于一种植物时产生的一种发生在种内的生长抑制作用，许多作物的连作障碍与此相关。另外，DBP对于人体健康具刺激性且具有雌激素作用，致突变、对胎儿有毒、对肌肉骨骼中枢神经系统有影响。
1.2 污染物的微生物修复
在现阶段研究中，生物修复包含了广义生物修复和狭义生物修复两种类型。广义的生物修复是指所有依靠生物包括植物、动物和微生物为主体进行吸收、降解、转化土壤中的污染物，从而使污染物的浓度降到可接受的范围或将有毒有害的污染物转化为无害的环境污染治理技术[5]，因而也可将生物修复系统地划分为植物修复、动物修复和微生物修复这三种类型。狭义的生物修复则是特指依靠微生物的作用来消除土壤中的微生物，或使污染物无害化的一种技术方法[6]。
1.2.1 微生物修复技术
微生物修复通过微生物的生命代谢活动来减少环境中的有毒有害物质或使其完全无害化，从而使受污染环境能部分或完全恢复到原始状态[7]。
1.2.2 高效复合菌的微生物修复
采用生物降解技术进行DBP处理时，如果有多种微生物共同参与，高效彻底降解DBP有机主分的结果可能会达到。对于单一菌株而言，即使经过多次的筛选和驯化，也很难突破其降解极限。相反地，高效微生物复合菌群则能够通过其菌种相互间的协同作用来构成一个结构相对稳定，功能较为广泛的高效复合菌群，从而可以迅速分解不同种类的有机物，并且促进彼此代谢，甚至抑制有害微生物群落的生长繁殖[8,9]。
1.2.3 高效复合菌的理论基础
微生物的不同菌群之间存在非常复杂的生态关系，通常表现为互相促进或抑制的关系[10]。
（1）促进关系。在自然环境中的，某些难以降解的有机物往往利用多种微生物菌群的共同作用才能够被完全的降解。而菌群之间的相互促进关系一般包含两种表现形式，一种表现为共生关系：存在共生关系的菌群能够依靠另一方提供的底物来促进彼此的生长发育，这种共代谢成为了一些污染物的主要代谢机制。另一种表现为互生关系：菌群相互之间能够满足彼此的营养发育需求，以促进彼此的生长，因而有利于提高对许多污染物的降解效率，像这种互生关系在菌群的降解过程中是十分常见的。
（2）竞争关系。同样地，降解微生物和其它一些生物相互之间也可能有着一定程度的竞争，例如对相关的营养因子与环境因子、生存发展空间的种种竞争。通常在这些情况下，菌群之间因为对生长因子的激烈竞争，一定程度上就会发生虽然环境当中有某种有机物的降解菌存在，但是却不可以有效地对其进行降解[11]。
当环境中共同存在着对同一底物起降解作用的多种菌株时，如果菌株相互之间具有的关系是协同作用时，那么其降解能力就会显著增加，若菌株相互之间存在的是竞争关系，则整个体系的降解效果显著降低。所以，要想获得高效复 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^3^5`1^9`1^6^0`7^2#
合菌，那对于组成菌株的选择是十分重要的，如果选择不当就会起到反作用，不能得到预期的降解效果。
1.3 凹土固定化微生物技术
1.3.1 凹土及其在固定化微生物方面的性能特点
凹凸棒石黏土( 简称凹土) 是一种粘土矿物，主要成分为坡缕石或坡缟石，是一种层链状结构的含水富镁锅硅酸盐粘土矿物，呈碱性，PH值为8.9。在我国储量丰富的凹凸棒土具有独特的纤维结构及分散性，耐高温，耐盐碱等良好的胶体性能、还具有较高的比表面积和吸附能力，也因其良好的特性被广泛地应用于诸多生产生活领域包括建材、采矿、化肥、食品、农药、印染、环保等[12]。凹土化学性质稳定，具有较大的比表面积和孔容，优异的胶体吸附性能，非常适合作为微生物吸附的载体。
1.3.2 固定化微生物技术
固定化微生物技术的作用原理：令微生物吸附于载体上，利用载体高密度密集且能够保持其活性和生物功能，而且若环境条件适宜可继续生长增殖，能够满足处理工艺的要求[13-17]。固定化微生物技术通常是采取物理或化学技术使游离的微生物固定在限定的空间区域，同时能够保持其催化降解活性，便于生产实践中的反复使用。这种技术能够很大程度提高微生物的降解效果，拥有游离微生物无法比拟的优点，例如：固定化微生物被吸附于载体内能够免受外部环境中有毒有害物质浓度过高导致的损伤；载体自身内环境能够促进内部菌种的生长增殖，从而利于快速提高其菌种的浓度；防止微生物流失、提高反应速率、增加微生物对毒性污染物的耐受能力，而且固液分离容易。
1.4 本研究的目的和意义
通过用不同微生物在不同条件下处理邻苯二甲酸二丁酯溶液，模拟辣椒连作自毒效应，研究微生物在不同条件下对DBP的降解能力，以DBP降解率为依据，筛选凹土固定芽孢杆菌方法及三种芽孢杆菌的配比方法，筛选凹土固定复合芽孢杆菌的制备方法，以期探索微生物对辣椒连作自毒物质的影响，为辣椒连作栽培提供依据。
DBP含量标准曲线如图4。处理数据后得到DBP含量和峰面积的标准曲线方程y=3.0168X+17.343，R2=0.91169，曲线拟合显著。
1 引言 1
1.1 邻苯二甲酸二丁酯 1
1.2 污染物的微生物修复 1
1.3 凹土固定化微生物技术 1
1.4 本研究的目的与意义 3
2 材料与方法 3
2.1 试验材料 3
2.2 试验方法 3
3 结果分析 5
3.1 芽孢杆菌母液的浓度确定 5
3.2 DBP含量标准曲线 7
3.3 凹土吸附芽孢杆菌适宜固液比的确定 8
3.4 凹土吸附芽孢杆菌适宜复合比的确定 8
3.5 固定芽孢杆菌适宜载体的确定 9
结论 11
致谢 12
参考文献 13
1 引言
目前，连作障碍已成为农业发展的瓶颈。化感作用是农作物连作障碍形成的重要原因，邻苯二甲酸二丁酯（DBP）作为辣椒主要化感物质之一，对连作障碍起着重要作用[1]。在现代化农业生产中，邻苯二甲酸二丁酯被大面积应用于农膜、杀虫剂、杀菌剂等的生产，因此也已列入农田土壤中最常被检出的有机污染物之一，而且邻苯二甲酸二丁酯也是辣椒作物根系分泌的潜力化感物质[2]。本文对凹土固定化芽孢杆菌对邻苯二甲酸二丁酯的影响进行综述，结合多次优化，阐明固定化芽孢杆菌与邻苯二甲酸二丁酯之间的关系，为有效解决农作物连作障碍问题及进行农作物的生态管理提供科学依据。
1.1 邻苯二甲酸二丁酯
1.1.1 邻苯二甲酸二丁酯的理化性质和来源
邻苯二甲酸二丁酯（DBP）是无色透明液体，具有芳香气味，溶解大多数有机溶剂和泾类，如醇、醚和苯。它作为聚氯乙烯最常用的增塑剂，能够提高制品的诸多性能包括其柔 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^3^5`1^9`1^6^0`7^2#
软性，同时它也常用作胶粘剂和印刷油墨的添加剂[3]。另外DBP也被用作一种杀体外寄生虫药，当然少量存在于土壤中。
1.1.2 邻苯二甲酸二丁酯的危害
在农产品尤其是在辣椒的化感作用中起主要作用的化学物质之一就是DBP。植物通过向环境分泌某些化学物质， 在其周围形成一个微环境区域，从而抑制或促进该区域内其它植物( 包括其自身) 生长的现象称为化感作用，其中自毒现象是化感作用的重要形式之一[4]。自毒作用是当受体和供体同属于一种植物时产生的一种发生在种内的生长抑制作用，许多作物的连作障碍与此相关。另外，DBP对于人体健康具刺激性且具有雌激素作用，致突变、对胎儿有毒、对肌肉骨骼中枢神经系统有影响。
1.2 污染物的微生物修复
在现阶段研究中，生物修复包含了广义生物修复和狭义生物修复两种类型。广义的生物修复是指所有依靠生物包括植物、动物和微生物为主体进行吸收、降解、转化土壤中的污染物，从而使污染物的浓度降到可接受的范围或将有毒有害的污染物转化为无害的环境污染治理技术[5]，因而也可将生物修复系统地划分为植物修复、动物修复和微生物修复这三种类型。狭义的生物修复则是特指依靠微生物的作用来消除土壤中的微生物，或使污染物无害化的一种技术方法[6]。
1.2.1 微生物修复技术
微生物修复通过微生物的生命代谢活动来减少环境中的有毒有害物质或使其完全无害化，从而使受污染环境能部分或完全恢复到原始状态[7]。
1.2.2 高效复合菌的微生物修复
采用生物降解技术进行DBP处理时，如果有多种微生物共同参与，高效彻底降解DBP有机主分的结果可能会达到。对于单一菌株而言，即使经过多次的筛选和驯化，也很难突破其降解极限。相反地，高效微生物复合菌群则能够通过其菌种相互间的协同作用来构成一个结构相对稳定，功能较为广泛的高效复合菌群，从而可以迅速分解不同种类的有机物，并且促进彼此代谢，甚至抑制有害微生物群落的生长繁殖[8,9]。
1.2.3 高效复合菌的理论基础
微生物的不同菌群之间存在非常复杂的生态关系，通常表现为互相促进或抑制的关系[10]。
（1）促进关系。在自然环境中的，某些难以降解的有机物往往利用多种微生物菌群的共同作用才能够被完全的降解。而菌群之间的相互促进关系一般包含两种表现形式，一种表现为共生关系：存在共生关系的菌群能够依靠另一方提供的底物来促进彼此的生长发育，这种共代谢成为了一些污染物的主要代谢机制。另一种表现为互生关系：菌群相互之间能够满足彼此的营养发育需求，以促进彼此的生长，因而有利于提高对许多污染物的降解效率，像这种互生关系在菌群的降解过程中是十分常见的。
（2）竞争关系。同样地，降解微生物和其它一些生物相互之间也可能有着一定程度的竞争，例如对相关的营养因子与环境因子、生存发展空间的种种竞争。通常在这些情况下，菌群之间因为对生长因子的激烈竞争，一定程度上就会发生虽然环境当中有某种有机物的降解菌存在，但是却不可以有效地对其进行降解[11]。
当环境中共同存在着对同一底物起降解作用的多种菌株时，如果菌株相互之间具有的关系是协同作用时，那么其降解能力就会显著增加，若菌株相互之间存在的是竞争关系，则整个体系的降解效果显著降低。所以，要想获得高效复 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^3^5`1^9`1^6^0`7^2#
合菌，那对于组成菌株的选择是十分重要的，如果选择不当就会起到反作用，不能得到预期的降解效果。
1.3 凹土固定化微生物技术
1.3.1 凹土及其在固定化微生物方面的性能特点
凹凸棒石黏土( 简称凹土) 是一种粘土矿物，主要成分为坡缕石或坡缟石，是一种层链状结构的含水富镁锅硅酸盐粘土矿物，呈碱性，PH值为8.9。在我国储量丰富的凹凸棒土具有独特的纤维结构及分散性，耐高温，耐盐碱等良好的胶体性能、还具有较高的比表面积和吸附能力，也因其良好的特性被广泛地应用于诸多生产生活领域包括建材、采矿、化肥、食品、农药、印染、环保等[12]。凹土化学性质稳定，具有较大的比表面积和孔容，优异的胶体吸附性能，非常适合作为微生物吸附的载体。
1.3.2 固定化微生物技术
固定化微生物技术的作用原理：令微生物吸附于载体上，利用载体高密度密集且能够保持其活性和生物功能，而且若环境条件适宜可继续生长增殖，能够满足处理工艺的要求[13-17]。固定化微生物技术通常是采取物理或化学技术使游离的微生物固定在限定的空间区域，同时能够保持其催化降解活性，便于生产实践中的反复使用。这种技术能够很大程度提高微生物的降解效果，拥有游离微生物无法比拟的优点，例如：固定化微生物被吸附于载体内能够免受外部环境中有毒有害物质浓度过高导致的损伤；载体自身内环境能够促进内部菌种的生长增殖，从而利于快速提高其菌种的浓度；防止微生物流失、提高反应速率、增加微生物对毒性污染物的耐受能力，而且固液分离容易。
1.4 本研究的目的和意义
通过用不同微生物在不同条件下处理邻苯二甲酸二丁酯溶液，模拟辣椒连作自毒效应，研究微生物在不同条件下对DBP的降解能力，以DBP降解率为依据，筛选凹土固定芽孢杆菌方法及三种芽孢杆菌的配比方法，筛选凹土固定复合芽孢杆菌的制备方法，以期探索微生物对辣椒连作自毒物质的影响，为辣椒连作栽培提供依据。
DBP含量标准曲线如图4。处理数据后得到DBP含量和峰面积的标准曲线方程y=3.0168X+17.343，R2=0.91169，曲线拟合显著。
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