茶树精胺合成酶基因启动子的克隆与序列分析
摘要：为探究茶树精胺合成酶基因CsSPMS在植物各组织的表达活性，以茶树（Camellia sinensis）品种‘迎霜’为试验材料，根据本课题组获得的CsSPMS的cDNA全长序列，利用TAIL-PCR克隆CsSPMS启动子。测序验证与生物信息学分析后发现，该启动子片段长870 bp，含有1个GATA-box，1个TATA-box，1个CAAT-box，1个WRKY作用元件，1个低温相关元件MYCONSENSUSAT，1个MYBCOREATCYCB1顺式作用元件等。为进一步分析CsSPMS 启动子的功能，构建了该基因启动子与GFP 基因融合的植物表达载体，为探讨茶树精胺合成酶基因的组织表达特性及该基因的启动子功能奠定基础。
目录
摘要3
关键词3
Abstract3
Key words3
引言4
1材料与方法4
1.1材料4
1.1.1 实验材料 4
1.1.2 实验试剂 4
1.1.3 主要实验仪器 5
1.2方法 5
1.2.1茶树叶片基因组DNA提取5
1.2.2 DNA的纯化检测5
1.2.3启动子的TAILPCR扩增6
1.2.4启动子序列生物信息学预测8
1.2.5 启动子表达载体构建 8
2结果与分析9
2.1茶树花粉基因组DNA的提取和TAILPCR产物鉴定9
2.2 序列测定及分析10
2.3茶树CsSPMS基因启动子表达载体的构建 10
3 讨论 11
致谢12
参考文献13
茶树精胺合成酶基因启动子的克隆与分析
引言
引言
启动子是调控基因表达过程中重要的转录调节因子，分析启动子时空表达模式可以精确可靠地定位基因的表达部位，对研究基因的时空表达模式和验证基因功能具有重要意义（Ayoubi & van DeVen，1996；聂丽娜 等，2008）。
多胺可通过氨丙基转移酶参与植物多种生理代谢调节过程，尤其在提高植物抵抗逆境胁迫中起到了重要作用。多
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^3^5^1^9^1^6^0^7^2^*
胺作为一种与植物抗逆性有关的物质，能够缓解植物所受到的伤害。近年来的研究表明多胺作为抗性物质或信号传导物质参与小麦、拟南芥等抵御低温胁迫。研究发现，腐氨酸可以作为对番茄叶片冷胁迫的响应物质。同时，腐氨酸合酶缺失型拟南芥抗低温胁迫的能力明显下降。外源亚精胺和精胺可以提高冷胁迫香蕉叶中过氧化物酶的活性，提高香蕉的抗寒能力。亚精胺在抵御黄瓜低温胁迫中也起到了重要作用。
拟南芥和水稻中多胺生物合成路径已经基本探明有两条合成腐胺的途径，腐胺作为合成过程中最初的一种多胺在特定酶的作用下不断地添加氨丙基形成亚精胺和精胺，与此同时，甲硫氨酸脱去羧基也能形成亚精胺和精胺。从腐胺到精胺的生物合成，是经过两个合成酶—亚精胺合成酶和精胺合成酶的催化。SPDS催化腐胺生成亚精胺，拟南芥中研究表明，SPDS 由两个基因编码：spd1和spd2。SPMS催化亚精胺与氨丙基结合生成精胺。而在茶树中未有SPMS基因及其启动子的报道。
本研究以茶树（Camellia sinensis）品种‘迎霜’为试验材料，根据本课题组获得的CsSPMS的cDNA全长序列，利用TAILPCR克隆CsSPMS启动子。为进一步分析CsSPMS 启动子的功能，构建了该基因启动子与GUS 基因融合的植物表达载体，为探讨茶树精胺合成酶基因的组织表达特性及该基因的启动子功能奠定基础。
1. 材料与方法
1.1材料
1.1.1 实验材料
茶树供试材料为栽植于南京市中山陵茶园的迎霜品种。
1.1.2 实验试剂
2xCTAB提取缓冲液（2 g CTAB、1.4 M NaCl、20 Mm EDTA、100 mM Tris?HCl、蒸馏水定容至100 mL）、氯仿/异戊醇（体积比24：1）、70 %乙醇；洋葱购于市场；大肠杆菌菌株DH5α感受态细胞及载体pJIT166与pBI121均由本实验室保存；MitoTracker? Red CMXRos购自Invitrogen公司；rTaq酶、ExTaq酶、pMD18T simple 载体、dNTPs、DNA Marker、T4 DNA 连接酶、限制性内切酶，购自TaKaRa公司，普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒购自OMEGA公司；质粒提取试剂盒购自 Axygen公司。PCR引物及DNA 测序由南京Genscript生物技术有限公司完成。其余为国产分析纯试剂。
1.1.3 主要实验仪器
垂直电泳仪(Vertical electrophoresis) (北京六一仪器制造厂，中国)；凝胶成像系统 (Sensi Capture，上海培清科技)；普通梯度PCR仪(TaKaRa，日本)；核酸蛋白分析仪 (Eppendorf，德国)；高速冷冻离心机(Eppendorf，德国)；微量移液器(Eppendorf，德国)；超净工作台(苏州净化SWCJ1FD单人单面，中国)。
1.2 实验方法
1.2.1茶树叶片基因组DNA的提取
用改良的CTAB法提取叶片的基因组DNA。操作步骤如下：
将CTAB提取缓冲液置于65℃水浴锅中预热至澄清；
用液氮预冷小研钵，倒入0.3g花粉，快速研磨（可不时加入少量液氮使研磨充分，小心花粉溅出）；
向小研钵中加入0.8ml CTAB提取缓冲液，搅拌成糊状，倒入2ml离心管中，65℃水浴15min；
加入等体积（约0.8ml）氯仿/异戊醇轻摇混匀，于10000 rpm离心5min；
用100μl移液器小心吸取上清（注意不要吸入黄色中间层）至另一个新离心管中；
重复步骤4、5；
加入2倍体积无水乙醇，上下颠倒数次，混匀后放入20℃沉淀15min以上；
10000 rpm离心5min，弃上清；
加入1ml预冷70%乙醇，10000 rpm离心5min，弃上清；
加入1ml预冷无水乙醇，10000 rpm离心5min，弃上清；
吸掉残余液体，将离心管放于通风橱吹干，加入适量（100μl） ddH2O溶解，20℃保存备用。
注：所有离心过程于4℃效果较好，室温亦可。
1.2.2 总DNA的纯化及检测
加2μl RNase（10mg/mL）酶液37℃保温1h；
加等体积氯仿/异戊醇，混匀，放置几分钟后10 000rpm离心5min；
重复上一步；
取上清置于新离心管，加1/5体积的3M NaAc混匀，加2.5倍体积的无水乙醇，混匀，室温放置几分钟；
目录
摘要3
关键词3
Abstract3
Key words3
引言4
1材料与方法4
1.1材料4
1.1.1 实验材料 4
1.1.2 实验试剂 4
1.1.3 主要实验仪器 5
1.2方法 5
1.2.1茶树叶片基因组DNA提取5
1.2.2 DNA的纯化检测5
1.2.3启动子的TAILPCR扩增6
1.2.4启动子序列生物信息学预测8
1.2.5 启动子表达载体构建 8
2结果与分析9
2.1茶树花粉基因组DNA的提取和TAILPCR产物鉴定9
2.2 序列测定及分析10
2.3茶树CsSPMS基因启动子表达载体的构建 10
3 讨论 11
致谢12
参考文献13
茶树精胺合成酶基因启动子的克隆与分析
引言
引言
启动子是调控基因表达过程中重要的转录调节因子，分析启动子时空表达模式可以精确可靠地定位基因的表达部位，对研究基因的时空表达模式和验证基因功能具有重要意义（Ayoubi & van DeVen，1996；聂丽娜 等，2008）。
多胺可通过氨丙基转移酶参与植物多种生理代谢调节过程，尤其在提高植物抵抗逆境胁迫中起到了重要作用。多
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^3^5^1^9^1^6^0^7^2^*
胺作为一种与植物抗逆性有关的物质，能够缓解植物所受到的伤害。近年来的研究表明多胺作为抗性物质或信号传导物质参与小麦、拟南芥等抵御低温胁迫。研究发现，腐氨酸可以作为对番茄叶片冷胁迫的响应物质。同时，腐氨酸合酶缺失型拟南芥抗低温胁迫的能力明显下降。外源亚精胺和精胺可以提高冷胁迫香蕉叶中过氧化物酶的活性，提高香蕉的抗寒能力。亚精胺在抵御黄瓜低温胁迫中也起到了重要作用。
拟南芥和水稻中多胺生物合成路径已经基本探明有两条合成腐胺的途径，腐胺作为合成过程中最初的一种多胺在特定酶的作用下不断地添加氨丙基形成亚精胺和精胺，与此同时，甲硫氨酸脱去羧基也能形成亚精胺和精胺。从腐胺到精胺的生物合成，是经过两个合成酶—亚精胺合成酶和精胺合成酶的催化。SPDS催化腐胺生成亚精胺，拟南芥中研究表明，SPDS 由两个基因编码：spd1和spd2。SPMS催化亚精胺与氨丙基结合生成精胺。而在茶树中未有SPMS基因及其启动子的报道。
本研究以茶树（Camellia sinensis）品种‘迎霜’为试验材料，根据本课题组获得的CsSPMS的cDNA全长序列，利用TAILPCR克隆CsSPMS启动子。为进一步分析CsSPMS 启动子的功能，构建了该基因启动子与GUS 基因融合的植物表达载体，为探讨茶树精胺合成酶基因的组织表达特性及该基因的启动子功能奠定基础。
1. 材料与方法
1.1材料
1.1.1 实验材料
茶树供试材料为栽植于南京市中山陵茶园的迎霜品种。
1.1.2 实验试剂
2xCTAB提取缓冲液（2 g CTAB、1.4 M NaCl、20 Mm EDTA、100 mM Tris?HCl、蒸馏水定容至100 mL）、氯仿/异戊醇（体积比24：1）、70 %乙醇；洋葱购于市场；大肠杆菌菌株DH5α感受态细胞及载体pJIT166与pBI121均由本实验室保存；MitoTracker? Red CMXRos购自Invitrogen公司；rTaq酶、ExTaq酶、pMD18T simple 载体、dNTPs、DNA Marker、T4 DNA 连接酶、限制性内切酶，购自TaKaRa公司，普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒购自OMEGA公司；质粒提取试剂盒购自 Axygen公司。PCR引物及DNA 测序由南京Genscript生物技术有限公司完成。其余为国产分析纯试剂。
1.1.3 主要实验仪器
垂直电泳仪(Vertical electrophoresis) (北京六一仪器制造厂，中国)；凝胶成像系统 (Sensi Capture，上海培清科技)；普通梯度PCR仪(TaKaRa，日本)；核酸蛋白分析仪 (Eppendorf，德国)；高速冷冻离心机(Eppendorf，德国)；微量移液器(Eppendorf，德国)；超净工作台(苏州净化SWCJ1FD单人单面，中国)。
1.2 实验方法
1.2.1茶树叶片基因组DNA的提取
用改良的CTAB法提取叶片的基因组DNA。操作步骤如下：
将CTAB提取缓冲液置于65℃水浴锅中预热至澄清；
用液氮预冷小研钵，倒入0.3g花粉，快速研磨（可不时加入少量液氮使研磨充分，小心花粉溅出）；
向小研钵中加入0.8ml CTAB提取缓冲液，搅拌成糊状，倒入2ml离心管中，65℃水浴15min；
加入等体积（约0.8ml）氯仿/异戊醇轻摇混匀，于10000 rpm离心5min；
用100μl移液器小心吸取上清（注意不要吸入黄色中间层）至另一个新离心管中；
重复步骤4、5；
加入2倍体积无水乙醇，上下颠倒数次，混匀后放入20℃沉淀15min以上；
10000 rpm离心5min，弃上清；
加入1ml预冷70%乙醇，10000 rpm离心5min，弃上清；
加入1ml预冷无水乙醇，10000 rpm离心5min，弃上清；
吸掉残余液体，将离心管放于通风橱吹干，加入适量（100μl） ddH2O溶解，20℃保存备用。
注：所有离心过程于4℃效果较好，室温亦可。
1.2.2 总DNA的纯化及检测
加2μl RNase（10mg/mL）酶液37℃保温1h；
加等体积氯仿/异戊醇，混匀，放置几分钟后10 000rpm离心5min；
重复上一步；
取上清置于新离心管，加1/5体积的3M NaAc混匀，加2.5倍体积的无水乙醇，混匀，室温放置几分钟；
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