赤霉素诱导白罗莎葡萄果核退化中木质素相关基因的时空表达分析
:施用赤霉素是生产上常见获取无核葡萄手段之一，但目前有关赤霉素诱导核退化分子机制尚不清楚。本研究以‘白罗莎’为试材，通过对VvPAL、VvCAD、Vv4CL基因序列结构分析发现，VvPAL、VvCAD、Vv4CL基因与木本类植物同源性均在85%以上，说明三个基因保守性较高。利用qRT-PCR技术分析了PAL、CAD、4CL在葡萄果核发育不同时期的时空表达及其应答赤霉素的模式，结果显示，木质素合成关键酶基因PAL、CAD、4CL在葡萄果核发育四个关键时期均受到赤霉素信号影响，且其表达被赤霉素抑制。本研究从分子水平认识了果核退化过程中赤霉素信号对木质素合成关键酶基因表达的影响，为进一步研究葡萄中赤霉素诱导葡萄果核退化的分子机制提供了理论依据。
目录
关键词 1
Abstract 1
Key words 2
1材料与方法 2
1.1 实验材料 2
1.1.1材料选择与处理 2
1.1.2基因组数据库序列来源 3
1.1.3主要仪器设备 3
1.1.4主要试剂 3
1.1.5生物信息学分析工具 3
1.1.6本地生物信息学分析软件 3
1.2 葡萄PAL、CAD和4CL生物信息学分析方法 3
1.2.1 葡萄PAL、CAD、4CL基因结构分析 3
1.2.2开放阅读框（ORF）分析与翻译 3
1.2.3基因同源性分析 3
1.2.4基因进化树的构建及蛋白功能结构域分析 3
1.3 葡萄PAL、CAD和4CL功能验证及荧光定量分析 4
1.3.1葡萄核区RNA的提取 4
1.3.2 葡萄cDNA合成 4
1.3.3 PAL、CAD和4CL基因的定量表达分析 5
1.4 葡萄硬核发育关键时期生理切片 5
2结果与分析 6
2.1葡萄硬核发育关键时期的果实横切图 6
2.2葡萄PAL、4CL和CAD基因序列的基本分析 6
2.2.1基因结构分析 6
2.2.2氨基酸序列的翻译 7
2.3基因同源性分 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: #351916072#
析与进化性分析 7
2.4蛋白质结构域分析 13
2.5 RNA提取与内参基因标定 14
2.5.1 检测RNA的完整性 14
2.5.2内参基因标定 14
2.6 葡萄木质素合成关键酶基因在处理与对照的花果发育过程中的时空表达分析 15
2.7 赤霉素与木质素合成关键酶基因的相关性分析 16
3讨论 17
致谢 18
参考文献： 19
赤霉素诱导“白罗莎”葡萄果核退化中木质素相关基因的时空表达分析
引言
赤霉素(gibberellin)是五大重要的激素之一，调控植物生长发育中的多种生理过程。葡萄作为热门经济树种，于30年代起就有研究赤霉素对葡萄的影响[1]。在实际栽培中，施用赤霉素能提高座果率、诱导无核果实以及增大果粒等[2]。在本实验室前期研究发现，于葡萄花前10天施用赤霉素能达到95%无核率[3]。核区消失与葡萄响应赤霉素有关，而核区消失又是木质素不表达的表现。目前有关赤霉素调控木质素合成影响果核发育研究尚未见报道。
在葡萄硬核形成过程中，会出现细胞壁内木质素积累现象，即发育木质化现象。这一现象主要出现在植物木质部、种子种皮和果实果皮中。近几年，关于木质素在果实中合成机制的研究愈来愈多，如枣[4]、桃[5]、梨[6]等。但在葡萄中，关于木质素的研究却很少。木质素是高等植物天然化合物中含量仅次于纤维素的有机物，主要由单体木质素聚合而成[7]。木质素能增强细胞壁，转运水分，提供保护机制以及应对环境胁迫[8]。目前，木质素单体的合成途径，已经基本研究清楚[8][9][10]。合成途径由三个阶段构成：第一阶段：莽草酸代谢；第二阶段： 苯丙氨酸代谢；第三阶段：木质素合成的特异途径；在这三个阶段中，苯丙氨酸解氨酶（Phenylalanine Ammonia Lyas,PAL)、4香豆酸辅酶A连接酶（4CoumarateCo A ligase,4CL)、肉桂醇脱氧酶（Cinnamylalcohol dehydrogenase,CAD)为控制木质素合成的三个关键酶。PAL调控肉桂酸合成，是苯丙氨酸途径的第一个限速酶[11]。PAL存在于大部分高等植物中，影响植物木质化过程并在抗虫、抗逆等过程中起到重要作用[12]。有研究表明[13]，抑制PAL基因在烟草中的表达，会导致木质素含量降低。4CL位于苯丙氨酸生物合成途径的分支点上[14]，是控制碳流进入下游不同代谢支路的关键酶[15]。在拟南芥[16]、烟草[17]、大豆[18]等植物中，已经分离克隆出4CL基因。研究表明，在山杨中，利用反义RNA技术抑制4CL基因表达，能够使木质素含量下降45%左右[19]。CAD是催化木质素单体合成的最后一步，拟南芥[][][]、水稻[]和杨树[]等植物中都分别克隆出CAD基因，具有高度同源性。另有研究发现于转基因烟草、杨树、拟南芥植物中，降低CAD表达并不会影响木质素含量表达[]。为此本实验选择此3个基因，以‘白罗莎’葡萄为试材，利用赤霉素诱导欧涛无核来分析赤霉素对木质素的影响，分别于花前7天通过赤霉素蘸花穗处理，采集不同时期的果实的样品，进行切片观察后通过qRTPCR技术研究，木质素合成关键基因PAL、4CL、CAD不同时期的时空表达水平。并用生物信息学分析其序列、结构、染色体位置、保守结构域和同源性等情况，为葡萄木质素合成关键酶基因PAL、4CL、CAD的功能分析奠定基础。
1材料与方法
1.1 实验材料
1.1.1材料选择与处理
本试验选用大学句容实验基地多年生品种‘白罗莎’葡萄为试材。根据本实验室以往的研究证明，花前10天处理能达到98%的无核率[3]。在花蕾形成初期用40ppmGA浸蘸花穗，依据‘白罗莎’生长发育特性，分别于葡萄幼果膨大期、硬核期、第二次果实膨大期和转色期采集不同植株不同部位的果实样品。采集后样品用液氮速冻后保存于20℃冰箱。
目录
关键词 1
Abstract 1
Key words 2
1材料与方法 2
1.1 实验材料 2
1.1.1材料选择与处理 2
1.1.2基因组数据库序列来源 3
1.1.3主要仪器设备 3
1.1.4主要试剂 3
1.1.5生物信息学分析工具 3
1.1.6本地生物信息学分析软件 3
1.2 葡萄PAL、CAD和4CL生物信息学分析方法 3
1.2.1 葡萄PAL、CAD、4CL基因结构分析 3
1.2.2开放阅读框（ORF）分析与翻译 3
1.2.3基因同源性分析 3
1.2.4基因进化树的构建及蛋白功能结构域分析 3
1.3 葡萄PAL、CAD和4CL功能验证及荧光定量分析 4
1.3.1葡萄核区RNA的提取 4
1.3.2 葡萄cDNA合成 4
1.3.3 PAL、CAD和4CL基因的定量表达分析 5
1.4 葡萄硬核发育关键时期生理切片 5
2结果与分析 6
2.1葡萄硬核发育关键时期的果实横切图 6
2.2葡萄PAL、4CL和CAD基因序列的基本分析 6
2.2.1基因结构分析 6
2.2.2氨基酸序列的翻译 7
2.3基因同源性分 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: #351916072#
析与进化性分析 7
2.4蛋白质结构域分析 13
2.5 RNA提取与内参基因标定 14
2.5.1 检测RNA的完整性 14
2.5.2内参基因标定 14
2.6 葡萄木质素合成关键酶基因在处理与对照的花果发育过程中的时空表达分析 15
2.7 赤霉素与木质素合成关键酶基因的相关性分析 16
3讨论 17
致谢 18
参考文献： 19
赤霉素诱导“白罗莎”葡萄果核退化中木质素相关基因的时空表达分析
引言
赤霉素(gibberellin)是五大重要的激素之一，调控植物生长发育中的多种生理过程。葡萄作为热门经济树种，于30年代起就有研究赤霉素对葡萄的影响[1]。在实际栽培中，施用赤霉素能提高座果率、诱导无核果实以及增大果粒等[2]。在本实验室前期研究发现，于葡萄花前10天施用赤霉素能达到95%无核率[3]。核区消失与葡萄响应赤霉素有关，而核区消失又是木质素不表达的表现。目前有关赤霉素调控木质素合成影响果核发育研究尚未见报道。
在葡萄硬核形成过程中，会出现细胞壁内木质素积累现象，即发育木质化现象。这一现象主要出现在植物木质部、种子种皮和果实果皮中。近几年，关于木质素在果实中合成机制的研究愈来愈多，如枣[4]、桃[5]、梨[6]等。但在葡萄中，关于木质素的研究却很少。木质素是高等植物天然化合物中含量仅次于纤维素的有机物，主要由单体木质素聚合而成[7]。木质素能增强细胞壁，转运水分，提供保护机制以及应对环境胁迫[8]。目前，木质素单体的合成途径，已经基本研究清楚[8][9][10]。合成途径由三个阶段构成：第一阶段：莽草酸代谢；第二阶段： 苯丙氨酸代谢；第三阶段：木质素合成的特异途径；在这三个阶段中，苯丙氨酸解氨酶（Phenylalanine Ammonia Lyas,PAL)、4香豆酸辅酶A连接酶（4CoumarateCo A ligase,4CL)、肉桂醇脱氧酶（Cinnamylalcohol dehydrogenase,CAD)为控制木质素合成的三个关键酶。PAL调控肉桂酸合成，是苯丙氨酸途径的第一个限速酶[11]。PAL存在于大部分高等植物中，影响植物木质化过程并在抗虫、抗逆等过程中起到重要作用[12]。有研究表明[13]，抑制PAL基因在烟草中的表达，会导致木质素含量降低。4CL位于苯丙氨酸生物合成途径的分支点上[14]，是控制碳流进入下游不同代谢支路的关键酶[15]。在拟南芥[16]、烟草[17]、大豆[18]等植物中，已经分离克隆出4CL基因。研究表明，在山杨中，利用反义RNA技术抑制4CL基因表达，能够使木质素含量下降45%左右[19]。CAD是催化木质素单体合成的最后一步，拟南芥[][][]、水稻[]和杨树[]等植物中都分别克隆出CAD基因，具有高度同源性。另有研究发现于转基因烟草、杨树、拟南芥植物中，降低CAD表达并不会影响木质素含量表达[]。为此本实验选择此3个基因，以‘白罗莎’葡萄为试材，利用赤霉素诱导欧涛无核来分析赤霉素对木质素的影响，分别于花前7天通过赤霉素蘸花穗处理，采集不同时期的果实的样品，进行切片观察后通过qRTPCR技术研究，木质素合成关键基因PAL、4CL、CAD不同时期的时空表达水平。并用生物信息学分析其序列、结构、染色体位置、保守结构域和同源性等情况，为葡萄木质素合成关键酶基因PAL、4CL、CAD的功能分析奠定基础。
1材料与方法
1.1 实验材料
1.1.1材料选择与处理
本试验选用大学句容实验基地多年生品种‘白罗莎’葡萄为试材。根据本实验室以往的研究证明，花前10天处理能达到98%的无核率[3]。在花蕾形成初期用40ppmGA浸蘸花穗，依据‘白罗莎’生长发育特性，分别于葡萄幼果膨大期、硬核期、第二次果实膨大期和转色期采集不同植株不同部位的果实样品。采集后样品用液氮速冻后保存于20℃冰箱。
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